Relaxasen, Schlüsselenzyme der bakteriellen Konjugation

Die bakterielle Konjugation ist der vorherrschende Mechanismus zur horizontalen Weitergabe gentischer Information zwischen Bakterien. Durch Konjugation wird die schnelle Verbreitung und Etablierung von Genen, die für das Überleben der Bakterien unter Stressbedingungen notwendig sind, ermöglicht. Im Falle pathogener Bakterien bewirkt die Entstehung und Verbreitung von Multiresistenzplasmiden ein weltweites Wiederauftreten infektiöser bakterieller Krankheiten auf Grund der rasant zunehmenden Unwirksamkeit von Antibiotikabehandlungen. Um dieses weltweite Problem in den Griff zu bekommen gibt es mehrere Ansätze, wie z.B. die Entwicklung von Impfungen oder die Suche nach neuen Antibiotika. Wir haben auf der Suche nach Alternativen ein EU-Konsortium gegründet mit dem Ziel, spezifische Inhibitoren gegen die bakterielle Konjugation (COINS - Conjugation Inhibitors) zu identifizieren. Dieser Ansatz zur Kontrolle infektiöser bakterieller Krankheiten hat im Unterschied zu traditionellen Ansätzen nicht die Bekämpfung pathogener Bakterien direkt, sondern die Vermeidung der Verbreitung der Antibiotikaresistenzen zum Ziel. Zur Vorbereitung und Unterstützung des europäischen Projekts beantragen wir ein Projekt auf nationaler Ebene, das die strukturelle und biochemische Charakterisierung von Schlüsselenzymen der bakteriellen Konjugation zum Ziel hat. Plasmid-codierte Relaxasen und DNA-bindende Helferproteine sind essentielle Komponenten des Plasmidtransfers - eine Inhibition einer dieser Komponenten würde den konjugativen DNA-Transfer verhindern. 1. Das Hauptziel dieses Projekts ist die Strukturanalyse mit Hilfe der Kristallstrukturanalyse. 2. Biophysikalische Techniken, wie Circulardichroismus (CD), Fluoreszenzspektroskopie, Biokalorimetrie (DSC und ITC) werden zum Nachweis der Integrität der gereinigten Proteine verwendet und liefern wichtige Daten über die biochemischen Eigenschaften und das DNA-Bindungsverhalten der nativen Proteine sowie der Deletionsmutanten. Im Mittelpunkt der Untersuchungen stehen konjugative Plasmide aus der IncF- und IncP-Familie, und ein Vertreter der "Rolling Circle Replicating" (RCR) mobilisierbaren Plasmide, pMV158. Diese Systeme sind molekularbiologisch sehr gut charakterisiert, sie umspannen einen großen Bereich von Wirtspezifitäten (inklusive Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien) und die bisher bekannten biochemischen Daten lassen Unterschiede im Relaxationsmechanismus erwarten. Die Kenntniss der 3D-Struktur der Relaxasen und ihrer biochemischen Eigenschaften wird ein Verständniss des Reaktionsmechanismus ermöglichen, der der Initiation und Termination des Plasmidtransferprozesses zugrunde liegt. Weiters wird die Struktur von Relaxasen und anderen essentiellen Konjugationsproteinen eine Basis für das gezielte Design von Konjugationsinhibitoren (COINS) bilden und zur Verbesserung von Relaxase-spezifischen Inhibitoren (lead compounds), die im Rahmen des EU-Projektes entdeckt werden, dienen.

Die bakterielle Konjugation ist der vorherrschende Mechanismus zur horizontalen Weitergabe genetischer Information zwischen Bakterien. Durch Konjugation wird die schnelle Verbreitung und Etablierung von Genen, die für das Überleben der Bakteri-en unter Stressbedingungen notwendig sind, ermöglicht. Im Falle pathogener Bakte- rien bewirkt die Entstehung und Verbreitung von Multiresistenz-Plasmiden ein welt-weites Wiederauftreten infektiöser bakterieller Krankheiten aufgrund der rasant zu-nehmenden Unwirksamkeit von Antibiotikabehandlungen. Relaxasen sind die Schlüsselenzyme der bakteriellen Konjugation. Zusammen mit einer variablen Zahl von Helfer- Proteinen bilden sie das "Relaxosom", das für die Schlüsselschritte der bakteriellen Konjugation verantwortlich zeichnet: 1. die Orts-spezifische Spaltung der Plasmid DNA, 2. der Transfer der Single-Strand DNA von der Donor- zur Akzeptorzelle und 3. die Termination des Transfers. Im Mittelpunkt dieses Projekts steht die biophysikalische und strukturelle Charakteri-sierung der Relaxasen, die von konjugativen Plasmiden aus der IncF und IncP Fami-lie, und Relaxasen von Plasmiden Gram-positiver Bakterien, MobM des Plasmids pMV158 und TraA des Plasmids pIP501. Die Expressionssysteme für die nativen Relaxasen als auch für Truncationsmutanten wurden von unseren Kooperationspart-nern hergestellt. Wir haben die Expressionssysteme in unserem Labor etabliert und jeweils präparative Expressions- und Reinigungsprotokolle erstellt. Die gereinigten Proteine wurden mit biophysikalischen Methoden (CD-Spektroskopie, Fluoreszenz- spektroskopie, etc.) charakterisiert, um die Löslichkeit und die korrekte Faltung der Proteine zu gewährleisten. DNA-Bindungsstudien wurden mit TraA (pIP501), TraI (RP4), und Tra (Plasmid R1) durchgeführt. Sowohl die Relaxase Proteine als auch Relaxase-DNA-Komplexe wurden für Kristallisationsversuche verwendet. Im letzten Jahr wurde eine S-Layer Protein, SbsC des gram-positiven Bakteriums Geobacillus stearothermophilus in das Projekt aufgenommen. Kristalle von zwei Truncationsmutanten dieses S-Layer Proteins konnten erhalten werden und Streuda-ten zur Strukturbestimmung wurden gesammelt.