Zur Struktur und Funktion modifizierter Nukleotide in RNA

Chemisch modifizierte Nukleotide haben spätestens seit den ersten Kristallstrukturen von tRNA-Molekülen breite Aufmerksamkeit erlangt. Nicht zuletzt wegen des medizinisch-therapeutischen Potentials modifizierter Nukleoside wurden früh synthetische Methoden für ihre Darstellung entwickelt. Allerdings stellt der Einbau von modifizierten Nukleosiden in RNA-Moleküle nach wie vor eine der größten Herausforderungen für den Oligonukleotidchemiker dar. Bisher konnten überwiegend nur die einfachsten und stabilsten Modifikationen erfolgreich in die chemische Festphasensynthese von Nukleotidsequenzen einbezogen werden. Dies ist unter anderem ein Grund dafür, warum die Auswirkungen von modifizierten Nukleosiden auf die Struktur und Funktion von RNA weitgehend unbekannt sind. Dieses Forschungsgebiet öffnet sich aber in den letzten Jahren mehr und mehr aufgrund der neuesten Entwicklungen und Verbesserungen auf dem Gebiet der automatisierten Oligoribonukleotidsynthese und - reinigung. Mit dem vorgestellten Projekt behandeln wir im wesentlichen zwei Fragestellungen die im Zusammenhang mit zentralen biologischen Prozessen von Ribonukleinsäuren stehen, nämlich der ribosomalen Translation und der Faltung von RNA. Die erste Thematik basiert auf den von uns entwickelten cyclischen Oligoribonukleotidmodellen für die Codon- Anticodon-Paarung (Angewandte Chemie 2000, 39, 922-926; Titelbild). Auf diesen Verbindungen aufbauend können wir nun den Einfluss von konservierten chemisch modifizierten tRNA-Nukleotiden innerhalb und in der unmittelbaren Nachbarschaft der Anticodonsequenz auf die Paarungseigenschaften des eigentlichen Codon- Anticodon Komplexes untersuchen. Die Effekte, die von modifizierten Nukleotiden ausgehen, betreffen vor allem die Basenstapelung, sterische Wechselwirkungen, und die Metallionenkoordination. Mit unseren Modellverbindungen sind die thermodynamischen Paarungsparameter von RNA-Triplet-Wechselwirkungen bestimmbar und dies bietet die Möglichkeit eine Vielzahl von Decodierungsphänomenen, die die Genauigkeit der ribosomalen Translation beeinträchtigen, direkt anzusprechen. So behandelt eine Unterthematik die Fragestellung, ob die modifizierten Nukleotide in Position 37 der tRNAs einen Stabilitätsausgleich von Triplettpaarungen unterschiedlicher Sequenz bewirken. In einer zweiten Unterthematik wird nach thermodynamischen Präferenzen für die Codon-Anticodon-Paarung in spezifischen Sequenzabschnitten, die bei Leserahmenverschiebung auftreten, gesucht. Das Ziel dieser Forschung ist es zu einem fundierten Verständnis der molekularen Details ribosomaler Decodierungsprozesse beizutragen. Die zweite Thematik betrifft die Faltung von RNA. Dabei wird bisher den modifizierten Nukleotiden nur ein modulierender Einfluss zuerkannt. Wir haben jedoch erste experimentelle Hinweise, dass von Nukleotidmodifikationen eine aktive Beeinflussung im Hinblick auf die Ausbildung von Sekundärstrukturelementen ausgehen kann. So bewirkt zum Beispiel die positionsspezifissche Methylierung eines Guanosins in einer definierten Duplexsequenz die Strukturänderung hin zu den entsprechenden Haarnadelstrukturen. Wir wollen in einer breit angelegten Studie die Korrelationen von Sequenz, Methylierungsposition der Nukleobase und der Position dieses methylierten Nukleotids innerhalb der Sequenz ausfindig machen, die für derartige Strukturänderungen verantwortlich sind. In einer zweiten Stufe werden Sequenzabschnitte von methyliert vorkommender zellulärer RNA nach obigen Gesichtspunkten untersucht, um bevorzugte Faltungswege aufdecken zu können.

Das ursprüngliche wissenschaftliche Ziel des Projekts war eine detailierte Untersuchung zum Einfluß natürlich vorkommender Nukleosidmodifikationen auf die Struktur und Funktion von RNA. Die wichtigsten Resultate können wie folgt zusammengefaßt werden: Erstens untersuchten wir die Auswirkungen methylierter Nukleoside auf die Struktur und Faltung von RNA. Dabei stellte sich als wesentlich heraus, dass jene Nukleoside, die an der Watson-Crick Basenpaarungsseite methyliert sind, eine grundlegende Änderung der RNA Sekundärstruktur bewirken können, vorausgesetzt eine thermodynamisch günstige, alternative Basenpaarungsmöglichkeit ist in der entsprechenden Sequenz anzutreffen. Dieses Konzept ist mit hoher Wahrscheinlichkeit in der Natur verwirklicht, wie zum Beispiel in der kleinen ribosomalen Untereinheit, deren terminale Doppelhelix durch eine hochgradig methylierte Haarnadelschleife abgeschlossen ist. Mittels Modellverbindungen konnte gezeigt werden, daß das entsprechende Methylierungsmuster für die beobachtete Faltung verantwortlich ist und Fehlfaltungen des 3`-terminalen 16S rRNA-Abschnitts mit hoher Wahrscheinlichkeit verhindert. Zweitens wurde die Erkenntnis gewonnen, daß methylierte Nukleoside für die Selektion einer definierten Sekundärstruktur aus mehreren alternativen Möglichkeiten verantwortlich gemacht werden können. Dies wurde für die Entwicklung künstlicher Nukleosidbausteine und deren Einbau in RNA verwendet, um ein chemisches Werkzeug zu erhalten womit RNA Faltungsprozesse gesteuert werden können. Ein Beweis für dieses Konzept konnte am Beispiel so genannter Trichlorethyl-modifizierter RNA erbracht werden. Das Konzept ist für die Entwicklung von nicht-kodierenden RNAs, die regulativ zur Kontrolle der Genexpression eingesetzt werden können (`Riboregulatoren`), äußerst vielversprechend. Drittens wurde eine Studie zur Darstellung Selen-modifizierter RNA initiiert. Wir entwickelten grundlegende Schritte für eine robuste Methode zu ihrer kombinierten chemischen und enzymatischen Synthese. Selen- modifizierte RNA ist in der Röntgenstrukturanalyse von Nukleinsäuren von besonderer Bedeutung, da sie ein geeignetes Derivat für die einfache Phasierung der kristallographischen Daten darstellt. Dieser Entwicklung liegt unser Interesse zugrunde, die Struktur und Funktion von RNA nachhaltig zu hinterfragen und zu verstehen. Die Untersuchungen und die Entwicklung einer Synthesemethode für Selen-modifizierte RNA haben zu einer erfolgreichen Zusammenarbeit mit einem weltweit führenden Strukturbiologen geführt und waren die Basis für die erste Strukturbestimmung eines Ribozyms, welches die Bildung einer Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung katalysieren kann.