Definierte Stimulation von T Zellen

Dieses Projektes zielt auf die Erforschung der genauen. Erfordernisse, die der Zellmembranrezeptor-vermittelten Zellaktivierung zugrunde liegen. Dazu wollen wir ein Testverfahren entwickeln, das uns erlauben soll, Zellaktivierung mit bisher nicht bekannter Präzision online zu messen. Ein wesentlicher Teil dieses Testverfahrens beinhaltet die instrumentelle Verknüpfung der Atomkraftmikroskopie mit der Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie in einem Mikroskop, um sowohl Rezeptoren über deren Liganden zeitlich und quantitativ definiert zu stimulieren als auch die Antwort der Zelle auf den definierten Stimulus online zu bestimmen. Die Entwicklung dieses Mikroskops ist das Ziel eines separaten Projektes, welches von Dr. Jörg Enderlein vom Institut für Biophysik der Johannes Kepler Universität Linz eingereicht wurde (siehe Beilage). Das spezifische Ziel des gegenständlichen Projektes, welches eng mit dem technischen verknüpft ist, ist die Planung und Entwicklung der erforderlichen zellulären Versuchsanordnungen. Als Zielzellen wollen wir T Zellen benutzen, die eine zentrale Stellung im Immunsystem höherer Lebewesen spielen. Diese Zellen können für den Organismus gefährliche Krankheitserreger hochspezifisch erkennen und nach erfolgter Aktivierung zerstören. Das zentrale Molekül für die Aktivierung dieser Zellen ist der T-Zellrezeptor (TCR), der spezifisch ein antigenes Peptid, welches vom Krankheitserreger stammt, erkennt. Obwohl der TCR zu den am besten untersuchten Zelloberflächenrezeptoren gehört, sind die genauen Erfordernisse für eine wirkungsvolle T-Zellaktivierung nach wie vor unbekannt. Die Variablen inkludieren die Zahl der verwickelten TCRs, Valenz der Liganden, die Affinität, die Kinetik der Bindung sowie der Einfluß von Ko- Rezeptoren. Der Einsatz der in diesem Projekt vorgeschlagenen mikroskopischen Techniken soll eine Antwort auf diese fundamentalen Fragen der Immunologie liefern, weil sie eine präzise Stimulierung des TCR und seiner Ko- Rezeptoren erlauben werden. Zusammen mit den entwickelten zellulären Tests wird die T-Zellaktivierung nicht nur über individuelle, kombinierte oder kumulative TCR/Ko-Rezeptor Stimulationen untersucht sondern auch online verfolgt werden können, und dadurch ein klares Bild der T Zellaktivierung erhalten werden. Die Kenntnis über diesen zentralen immunologischen Prozeß besitzt große Bedeutung für die Entwicklung neuer Strategien, um die Immunantwort therapeutisch gezielt entweder auf eine Infektion zu lenken oder immunologische Toleranz auszulösen. Die Möglichkeit, das Immunsystem therapeutisch zwischen Aktivierung und Tolerisierung umschalten zu können, ist die Basis für die Entwicklung neuer Impfstoffe sowie für die spezifische Behandlung von verschiedenen immunologischen Erkrankungen (einschließlich Allergien - Asthma, atopische Dermatitis; Autoimmunerkrankungen - Polyarthritis, Arteriosklerose, Multiple Sklerose), welche durch Bruch der Toleranz des Immunsystems gegenüber harmlosen oder körpereigenen Substanzen verursacht sind.

Das Ziel dieses Projektes war, die zeitlich-räumliche Reorganisation von Schlüsselmolekülen des Signaltransduktionsweges in T-Zellen nach Pathogenerkennung durch Anwendung einer ultra-sensitiven Einzelmolekülanalysetechnik in lebenden Zellen zu studieren. Diese moderne Technik, die auch "single dye tracing" (SDT) genannt wird, hat tatsächlich neue Einsichten über die Funktion der getesteten Moleküle erbracht, sodass Schlüsselreaktionen im Signaltransduktionsweg von T-Zellen neu definiert werden können. Das Wissen über diesen zentralen Signaltransduktionsweg des Immunsystems ist Voraussetzung für die Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze, welche die Immunantwort entweder in Richtung Erkennung der Infektion oder in Richtung immunologischer Toleranz leiten. Die Möglichkeit das Immunsystem therapeutisch zwischen Aktivierung und Toleranz umzuschalten, ist die Basis zur Entwicklung neuer Impfstrategien sowie zur spezifischen Behandlung von verschiedenen immunologischen Krankheiten wie Allergien und Autoimmunkrankheiten. SDT, von unseren Partnern in Linz etabliert wurde und nur von wenigen Laboratorien weltweit beherrscht, ist die einzige Technik, die auf Grund ihrer Sensitivität die Bewegung und Funktion einzelner Moleküle in lebenden Zellen zu untersuchen erlaubt. Alle anderen verfügbaren Techniken ermöglichen nur die Messung der Gesamtheit der Moleküle bzw. der Zahl an Molekülen bis zur Sensitivitätsgrenze der jeweiligen Methode. Daher reihte das Journal "Science" die Einzelmolekülanalyse unter die zehn wissenschaftlichen Haupterrungenschaf-ten des Jahres 2003. Das spezifische Ziel dieses Projektes war die Herstellung von biologischen Reagenzien für die SDT-Technik. Wir verfolgten zwei alternative Wege: (i) Wir etablierten monovalente Antikörperfragmente, die an wichtige Signalmoleküle binden, und markierten diese mit fluoreszierenden Farbstoffen. Durch diese Reagenzien konnten wir zum ersten Mal die Bewegungen von Rezeptoren auf der Oberfläche von T-Zellen aufzeichnen und analysieren. Die erhaltenen Resultate zeigen ein neues Bild der Architektur der Plasmamembran und ihrer Umstrukturierung nach Pathogenerkennung. (ii) In lebenden Zellen können Antikörper nur an Oberflächenmoleküle binden. Um das Zellinnere zu erreichen, fusionierten wir Signalmoleküle mit Varianten des fluoreszierenden Proteins GFP. Die Verwendung dieser Reagenzien erlaubte uns, den molekularen Faltungsprozess von Lck zu visualisieren. Lck ist ein zentrales Molekül im Signaltransduktionsweg der T-Zellen, dessen Struktur starken Einfluss auf seine Aktivität hat. In einem anderen Teil des Projektes konnten wir einen wichtigen Marker für die Entwicklung von regulatorischen T-Zellen identifizieren. Diese Zellen spielen eine Schlüsselrolle in der Immunantwort und in der Prävention von Autoimmunreaktionen. Zusätzlich haben wir ein System etabliert, welches erlaubt, durch die Bindung eines Antikörpers an die Spitze einer miniaturisierten Nadel T-Zellen in einer räumliche-zeitlich definierten Weise zu stimulieren.