Kombinierte Einzelmolekülmikroskopie

Das Hauptziel des vorgeschlagenen Projekts ist die Kombination zwei etablierter, technologisch hochentwickelter Methoden der Einzelmolekülspektroskopie, und zwar der Atomkraftmikroskopie (AFM) und der Weitfeld- Fluoreszenzmikroskopie, um die Reaktion von T-Zellen nach lokalisierter und kontrollierter Stimulation spezifischer T-Zell-Rezeptoren zu untersuchen. Das AFM erlaubt die Lokalisierung individueller Moleküle mit höchster räumlicher Auflösung im Subnanometerbereich, und darüber hinaus die Identifikation dieser Moleküle durch Kraftspektroskopie (vermittels Messung der Wechselwirkungskräfte der spezifischen Bindung zwischen dem Zielmoleküle und einem an der AFM-Spitze gebundenen Testmoleküle). Des weiteren kann das AFM dazu benutzt werden, Liganden kontrolliert und lokalisiert an spezifische molekulare Rezeptoren zu binden. Die Fluoreszenzdetektion einzelner Moleküle mit dem Weitfeldmikroskop ist ein ausgezeichnetes, ultimativ sensitives Verfahren, um fluoreszent markierte einzelne Moleküle auf und in Zellen zu verfolgen, was das Studium der Reorganisation der zellulären Struktur und die Detektion von Wechselwirkungen verschiedener Moleküle auf Einzelmolekülniveau erlaubt. Die Kombination beider Mikroskopietechniken eröffnet völlig neue Möglichkeiten für das Studium einzelner Zellen. Das AFM erlaubt die Lokalisierung spezifischer Rezeptormoleküle auf der Zelloberfläche (receptor mapping), und die nachfolgende gezielte Stimulierung einer definierten Anzahl von Rezeptoren mit exakter Zeit- und Ortskontrolle. Nach erfolgter Stimulation kann dann die zelluläre Antwort durch Fluoreszenzmikroskopie mit dem WFM mit höchster zeitlicher (Millisekunden) und räumlicher (100 nm) Auflösung verfolgt werden (z.B. Reorganisationen in der Zellmembran, Konjugation von Rezeptoren, stukturelle Veränderungen der Rezeptormoleküle, biochemische Transformationen, oder die =D6ffnung von Ionenkanälen). T-Zellen sind eine der wesentlichen Mitspieler bei der Immunantwort lebender Organismen. Die Untersuchung ihrer Antwort auf externe Stimuli und das Studium der notwendigen Bedingungen für ein erfolgreiches Auslösen ihrer immunologischen Funktionen ist von großem fachlichen Interesse, sowohl hinsichtlich des grundlagenwissenschaftlichen Aspekts wie hinsichtlich vieler Anwendungen in der medizinischen Immunologie. Aus diesem Grund wurde die Untersuchung der T-Zell-Antwort als biologisches Testsystem für die Anwendung des kombinierten AFM/WFM-Aufbaus ausgewählt. Das vorgeschlagene Projekt stellt sich das Ziel, eine qualitativ neue Ebene beim Studium der Molekular- und Zellbiologie lebender Zellen zu erreichen. Dabei ist die Kombination von AFM und einzelmolekülsensitiver WFM nicht einfach eine Addition zweier Techniken, sondern erlaubt das Studium komplexer Zusammenhänge, welches mit den beiden Techniken für sich genommen nicht durchführbar wäre.

Die Auslösung einer Immunantwort beruht auf der spezifischen Aktivierung von T Zellen. Der kritische Schritt stellt dabei die korrekte Erkennung des Antigens dar: während Agonisten eine T Zell Aktivierung induzieren, treiben Antagonisten die Zelle in Anergie. Der Erkennungsprozess läuft in der Kontaktzone zwischen antigen- präsentierender Zelle und T Zelle ab, welche in Analogie zum Nervensystem als immunologische Synapse bezeichnet wird. In dieser Synapse wird eine hochorganisierte Struktur aus Rezeptor- und Korezeptormoleküle ausgebildet. Der entscheidende Schritt stellt die Bindung des T Zell Rezeptors in der T Zelle an das präsentierte Antigen in der gegenüberliegenden antigen-präsentierenden Zelle dar. Allerdings sind kaum Informationen über diesen zentralen Erkennungsschritt bekannt, vor allem aufgrund eines Mangels an geeigneten Messtechniken. Dieses Projekt zielte daher darauf ab, eine geeignete Technik zu entwickeln, um die Aktivierung der T Zelle auf der Ebene einzelner Biomoleküle zu untersuchen. Zusammen mit unseren Kooperationspartnern in Wien und Stanford etablierten wir Protokolle zur T Zell Aktivierung auf einem mikroskop-basierten System, eine Grundvoraussetzung für die hochaufgelöste Erfassung dieses Prozesses. Einzelne Biomoleküle wurden während ihrer Bewegung in der komplexen Umgebung der Synapse beobachtet. Die zurückgelegten Wege dieser Moleküle wurden analysiert, um Einblick in die Heterogenitäten deren lokaler Umgebung zu gewinnen, ein zurzeit heiß diskutiertes Thema in der Zellbiologie. Dabei haben wir herausgefunden, dass nanometer-große Lipid-Domänen wesentlich heterogener sind, als allgemein angenommen. Einzelmolekül-Trajektorien beinhalten auch Information über die Bindungswahrscheinlichkeit des T Zell Rezeptors an das peptid-beladene MHC Molekül. Es gelang uns, diesen Interaktionsprozess direkt in der Synapse zu messen, wodurch jetzt erstmals diese kritischen Parameter insbesondere für theoretische Modellierungen zugänglich werden. Darüber hinaus ermöglicht der Vergleich verschiedener Peptide eine Aussage darüber, welche Erkennungsgröße bestimmend für die Immunantwort ist. Zusätzlich zu Einzelmolekülmessungen an lebenden T Zellen entwickelten wir neue Messmodi, um die Möglichkeiten der Technik zur Charakterisierung kleinster Strukturen auf lebenden Zellen voll auszunützen. Zunächst kombinierten wir optischen Mikroskopie mit Kraftmikroskopie: Während das Kraftmikroskop die spezifische Aktivierung der T Zelle mit einem einzelnen Antigen-Molekül ermöglicht, kann mit dem optische Mikroskop gleichzeitig die Zellantwort beobachtet werden. Weiters entwickelten wir eine Methode zur Charakterisierung von Aggregationsprozessen in der Zellmembran, welche häufig den entscheidenden Schritt für die Initiierung von zellulärer Signalisierung darstellen.