Regulation und Funktion von Notch2 in B-CLL

Vertreter der Notch Genfamilie kodieren für Transmembranrezeptoren, welche die Differenzierung von Vorläuferzellen regulieren. Der intrazelluläre Teil (NotchIC) dieser Rezeptoren fungiert als Transkriptionsfaktor, der nach Aktivierung in den Zellkern transloziert und dort den Transkriptionsfaktor CBF1 aktiviert. Unsere bisherigen Studien haben gezeigt, daß die Deregulation des Notch2 Signaltransduktionsweges für die Überexpression des B-Zell Differenzierungsmarkers CD23 in der chronisch lymphatischen Leukämie (B-CLL) verantwortlich sein dürfte. Promotoranalysen haben zur Identifikation eines Transkriptionsfaktorkomplexes geführt, der sequenzspezifisch an fünf CBF1 Bindungsstellen im CD23a Promotor bindet. Die Bedeutung dieses Faktors wurde durch eine strikte Korrelation zwischen dessen Intensität und der CD23a Transkription untermauert. Expressionsstudien ergaben, daß der CBF1 Aktivator Notch2 in B-CLL Zellen überexprimiert ist und ein Bestandteil des zuvor beschriebenen Transkriptionsfaktorkomplexes ist. Die Deregulation des Notch Signal- transduktionsweges führt in Zellen zu einem Differenzierungsarrest und zu einer Hemmung des programmierten Zelltodes (Apoptose). Folglich wäre der Phänotyp der B-CLL Zellen durch die Expression eines konstitutiv aktiven Notch2 Proteins erklärbar. Um diese Hypothese zu untermauern, ist die Transduktion von primären B-Zellen und von diversen CD23 negativen B-Zell Linien, die unterschiedliche Differenzierungsstufen repräsentieren, mit einem retroviralen Notch2IC Expressionsvektor geplant. Diese "gain of function" Experimente sollen nicht nur bestätigen, daß CD23 über Notch2 reguliert wird, sondern auch mit Hilfe von "cDNA microarrays" die phänotypischen und genotypischen Veränderungen, die über Notch2 in B-Zellen gesteuert werden, entschlüsseln. Desweiteren sollen diese Experimente auch eine mögliche Involvierung von Notch2 in die maligne Transformation von primären B- Zellen demonstrieren. Da bis dato wenig über die Funktion von Notch2 in der B-Zell Entwicklung bekannt ist, werden auch aufgereinigte B-Zell Subpopulationen von gesunden Spendern und repräsentative Proben von B-CLL ähnlichen Non Hodgkin Lymphomen, auf Unterschiede in ihrer Notch2 Expression untersucht. Außerdem soll mit Hilfe von Northern und Western blot Analysen die Frage geklärt werden, ob, bedingt durch noch unbekannte genetische Defekte, es zur Expression von verstümmelten, konstituitiv aktiven Notch2 Proteinen in der B-CLL kommt.

Die chronisch lymphatische Leukämie (B-CLL) ist durch eine graduelle Vermehrung von CD5/CD19/CD23 positiven monoklonalen B-Lymphozyten gekennzeichnet, denen ein Defekt im programierten Zelltod (Apoptose) zugrundeliegt. Mit Hilfe von Promotoranalysen konnten wir kürzlich zeigen, dass die Notch2 Signaltransduktion für die Überexpression von CD23 in der B-CLL verantwortlich ist. Da das Notch2 Onkogen einen determinierenden Faktor für die Entwicklung von CD5 positiven B-Zellen darstellt, könnte Notch2 eine zentrale Rolle für die B-CLL Pathogenese spielen. Tatsächlich wurde im Rahmen dieses Projektes entdeckt, dass B-CLL Zellen eine Liganden unabhängige, neoplastische Form von Notch2 (Notch2IC) exprimieren. Die transkriptionelle Aktivität dieses onkogenen Notch2IC Proteins hängt von der Proteinkinase C delta (PKC-d) ab, wodurch sich die aberrante Regulation von CD23 durch Phorbolesther (TPA) und Interferon- in der B-CLL erklären läßt. Weiters wurde eine signifikante Korrelation zwischen der Notch2IC Aktivität und den anti-apoptotischen Eigenschaften von kultivierten B-CLL Zellen gefunden. Der aktivierte anerge Zustand der B-CLL Zellen legte den Verdacht nahe, dass die leukämischen Zellen nicht über die B-Zell Rezeptor vermittelte Apoptose (AICD), abgetötet werden können. Um eine mögliche Involvierung von Notch2 in diesem Phänomen zu untersuchen, wurden B-Zellen mit einer neoplastischen Notch2IC Form retroviral transduziert. Mit Hilfe dieser Strategie konnte eindeutig gezeigt werden, dass onkogenes Notch2IC B-Zellen vor der B-Zell Rezeptor vermittelten Apoptose schützt (positive Selektion). Zusammenfassend ergibt sich daraus ein Modell, wo die Deregulation der Notch2 Signaltransduktion zu einer kontinuierlichen Vermehrung von CD5 positiven anergen B-Zellen in der B-CLL führt, die nicht über den zentralen Mechanismus der negativen Selektion in Homöostase gehalten werden können.