Mechanismus und Spezifität von alpha-Glucan Phosphorylase

Glycogenphosphorylasen sind Enzyme des intrazellulären Kohlenhydratstoffwechsel. Ihre wesentliche Aufgabe besteht in der raschen Bereitstellung von Energie, wenn aufgrund spezieller physiologischer Anforderungen gespeicherte Kohlenhydratreserven abgebaut werden müssen. Den Glycogenphosphorylasen kommt aufgrund ihrer zentralen Rolle im Stoffwechsel auch eine wichtige regulatorische Funktion zu. Während viele Mikroorganismen einfach jene Menge an Enzym produzieren, die in der jeweiligen Situation gerade benötigt wird, haben höhere Organismen eine Reihe von zusätzlichen Möglichkeiten entwickelt, mit deren Hilfe die Aktivität der Glycogenphosphorylase als Antwort auf extrazelluläre und hormonelle Signale gesteuert werden kann. Regulation durch reversible Proteinphosphorylierung und allosterische Effektoren sind klassische Besipiele,welche untrennbar mit dem Studium der Glycogenphosphorylase verbunden sind. Die Mechanismen der Regulation der Glycogenphosphorylase aus Hefe und aus tierischem Muskelgewebe ist bis in die molekularen Details geklärt. Die Forschung an Glycogenphosphory-lase hat langjährige Tradition, beginnend etwa mit 1930, und hat viele Bereiche der modernen Biochemie, Strukturbiologie und Zellbiologie entscheidend mitbeeinflußt und geprägt. Trotz der hervorragenden wissenschaftlichen Basis zu Fragen von Struktur und Funktion voin Glycogenphosphorylase sind bis heute eine Reihe von wesentlichen Fragen nicht geklärt. Diese betreffen wichtige Details des katalytischen Mechanismus und die Frage, wie Glycogenphosphorylase ihr polymeres Substrat erkennt und wie Spezifität für unterschiedliche, in ihrer Grundstruktur aber sehr ähnliche Substrate erzeugt wird. Es ist nicht genau bekannt, welche Bereiche der Proteinstruktur von verschiedenen Phosphorylasen für die Interaktion mit dem Polysaccharid verantwortlich sind und wie gegebenfalls die Kommunikation zwischen zwei verschiedenen Substratbindungsstellen, eine davon im aktiven Zentrum des Enzyms, vor sich geht. Um diese Fragen, die nicht nur für die Forschung an Glycogenphosphorylasen sehr relevant sind sondern auch breite Bedeutung für das Verständnis anderer Phosphorylasen und Glycosyltransferasen haben können, zu beantworten, wurde die Stärkephosphorylase aus dem Bakterium Corynebacterium callunae als Modellsystem gewählt. Die Spezifität des Enzyms für Polysaccharide, die gute Manipulierbarkeit der Proteinstruktur durch molekularbiologische Methoden und die einfache Gewinnung von zielgerichtet modifizierten Enzymvarianten, das Fehlen von regulatorischen Eigenschaften bei gleichzeitig vorhandenen Analogien zu Phosphorylasen aus höheren Organismen sowie einige wesentliche praktische Aspekte der experimentellen Durchführung lassen die Auswahl dieses Enzyms als sehr sinnvoll erscheinen. Das Projekt möchte durch die Anwendung von ortsspezifischer Mutagenese und speziellen Techniken der Enzymkinetik in Kombination mit hochauflösender röntgenkristallografischer Strukturaufklärung die Fragestellungen bearbeiten und will Antworten auf molekularer Ebene geben. Die Strukturaufklärung wird in der Gruppe von Prof. L. Johnson in Oxford durchgeführt und es sei erwähnt, daß diese Gruppe hauptverantwortlich für die Ermittlung der bisher vorhandenen Strukturdaten und des damit verbundenen Verständnis über Mechanismus und Regulation der Glycogenphosphorylase war. Die Arbeiten werden sich auf einen speziellen Aminosäurerest des aktiven Zentrums konzentrieren, das Histidin an Position 377, und es wird versucht durch Änderung dieses Restes in andere Aminosäuren den katalytischen Mechanismus des Enzyms besser zu verstehen und gegebenenfalls zu verändern. Die weiteren Kernpunkte des Projektes beziehen sich auf die Untersuchung der Kontaktzone zwischen den sogenannten Untereinheiten der Phosphorylase, mit dem Ziel die Rolle dieser Kontaktzone für Aktivität, Spezifität und Stabilität des Proteins zu ermitteln. Untersuchung zur postulierten Polysaccharidbindungsstelle in Stärkephosphorylase sollen in enger Kooperation mit der Strukturaufklärung erfolgen.

Kohlenhydrate stellen einer Gruppe von Biomolekülen dar, die sich durch enorme strukturelle Komplexität und funktionelle Vielfalt auszeichnen. Der breiteren Öffentlichkeit sind sie, oft einfach `Zucker` genannt, dadurch bekannt, dass sie wichtige Energieträger der menschlichen Nahrung darstellen und in vielen Fällen einen süßen Geschmack aufweisen. Neben der Funktion im primären Stoffwechsel spielen Kohlenhydrate aber weitere äußerst wichtige Rollen in der Physiologie der Zelle und stellen oft die Basis für Prozesse der biologischen Erkennung und Kommunikation dar. Unter der Gruppe an Enzymen, welche Transformationen an Kohlenhydraten katalysieren, stellen jene, die einzelne Monosaccharid-Einheiten in spezifischer Weise zu komplexeren Strukturen, sogenannten Oligosacchariden, miteinander chemisch verknüpfen, wohl die größte Herausforderung dar. Man klassifiziert diese Enzyme funktionell als Glykosyltransferasen. Die strukturelle und funktionelle Vielfalt unter den bekannten Glykosyltransferasen reflektiert die Komplexität der Reaktionsprodukte dieser Enzyme. Dieses Projekt leistete einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des katalytischen Mechanismus, also der molekularen Wirkungsweise von Glykosyltransferasen. Die gewonnenen Erkenntnisse, welche durch das Studium einer speziellen Gruppe von Glykosyltransferasen, den sogenannten Phosphorylasen, erhalten wurden, lassen sich auf Grund der bekannten Verwandtschaftsbeziehungen innerhalb der Enzymklasse breit extrapolieren und fördern die Basis für einerseits neue Anwendungen von Glykosyltransferasen in der Herstellung von seltenen Zuckern und andererseits die Entwicklung von therapeutischen Hemmstoffen. Das Projekt untersuchte unter Einsatz von biochemischen Methoden, mit speziellem Fokus auf kinetische Techniken, die Rolle spezieller Aminosäuren in drei Typen von Phosphorylasen aus Mikroorganismen und ermittelte detaillierte Wechselbeziehungen von Struktur und Funktion.