Die Rolle von Typ 3 CH Domänen

Wir haben vor Kurzem eine detaillierte Analyse aller verfügbaren Protein die eine CH Domäne (CHD) besitzen durchgeführt und daraufhin eine Gliederung in drei Grossfamilien vorgeschlagen: 1) Die Fimbrin Familie von monomeren Actin-Querverntzungsproteinen mit zwei unabhängien Actin Bindungs Domänen (ABDs), 2) dimere Actin-Querverntzungsproteine wie ?-Actinin, Filamin, ?-Spectrin, Plectin etc., und F-actin Bindungsproteine wie Dystrophin und Utrophin, welche jeweils eine ABD besitzen, sowie 3) Proteine mit nur einer einzelnen CH Domäne vom Typ 3. Die aminoterminalen (Typ 1) CHDs von Proteinen mit einer ABD weisen einen weit höheren Verwandtschaftsgrad zueinander als zu den carboxyterminalen Typ 2 CH Domänen auf. Typ 3 CH Domänen unterscheiden sich hingegen wiederum grundsätzlich sowohl von Typ 1 als auch von Typ 2 CH Domänen. Es gibt bereits eine Fülle von experimentellen Daten die eine unterschiedliche Affinität der Typ 1 und Typ 2 CHDs zu Aktin belegen, obwohl deren dreidimensionale Struktur sehr ähnlich ist. Es ist daher anzunehmen, dass die biologische Funktion von Typ 3 CH Domänen nicht von Versuchen an Typ 1 oder Typ 2 CHDs (oder gar intakten ABDs) abgeleitet werden kann. Umsomehr als sich gezeigt hat, dass der Austausch von Typ 3 CH Domänen durch analoge Module aus anderen Proteinen die Funktion der eigenen CH Domäne nicht wieder herzustellen in der Lage ist. Aus diesem Grund bedarf der Beitrag, den Typ 3 CH Domänen in der Regulation von Molekülen wie Vav oder IQGAP, welche die Funktion von Rho GTPasen steuern, aber auch von zytoskelettalen Proteinen wie Calponin oder SM22, deren biologische Funktion weitestgehend unverstanden sind leisten, einer detaillierten Untersuchung. Die Aufklärung der biologischen Funktion(en) von CH Domänen ist eine grosse Herausforderung, da sich dieses neue Proteinmodul sowohl in Zytoskelett-assoziierten Proteinen, aber auch in Molekülen die im Signalübertragungsweg zum Zytoskelett plaziert sind findet. Um die Funktionsweise dieses Moduls vollständig zu verstehen benötigen wir einen breiter angelegten Zugang in dem wir auch jene zusätzlichen Faktoren, die für die Definition der funktionellen Spezifität möglicherweise ausschlaggebend sind erfassen. In dem hier vorgelegten Projekt beabsichtigen wir diesen Fragen nachzugehen. Wir wollen untersuchen, welche in der Seuquenz konservierten Aminosäurereste die spezifischen Eigenschaften von Typ 3 CH Domänen in den jeweiligen Unterfamilien beeinflussen. Dazu sollen Punktmutationen und der Austauch ganzer Domänen vorgenommen werden. Die Auswirkung dieser Austausche auf die Lokalisationseigenschaften oder das Bindungsverhalten dieser Mutanten soll in zellbiologischen und biochemischen Untersuchungen analysiert werden.. Besonderes Augenmerk werden wir auf jene Regionen legen, die aufgrund der zum Teil bekannten Kristallstrukturen besonders für Protein- Protein Interaktionen präsdestinierte Oberflächen formen. Basierend auf unserer umfassenden Datenbank wollen wir die nun verfügbaren, beinahe kompletten Genombanken nach weiteren Typ 3 CH Domänen hältigen Molekülen durchsuchen. Schliesslich werden wir mit einer Kombination aus Co-immunopräzipitationen und der Anwendung des Hefe 2-Hybrid Systems nach neuen, spezifischen (aber auch gemeinsamen) Bindungspartnern für die verschiedenen Typ 3 CH Domänen suchen.

Ziel dieses Projektes war die Aufklärung der biologischen Funktion von Typ3 CH Domänen in Proteinen des Zytoskelettes und der Signalübertragungskaskaden unter Anwendung von gerichteter Mutagenese und dem gezielten Austausch von Domänen. Die Untersuchungen beinhalteten unter Anderem die Analyse der subzellulären Lokalisation und die Identifizierung möglicher neuer Bindungspartner durch Co-Immunpräzipitation, und das Hefe 2-Hybrid (Y2H) System. Für die CH Domänen von Vav und Calponin konnte eine verlässliche Interaktion mit dem Sathmin-verwandten Protein SCLIP, sowohl im Y2H als auch durch Immunpräzipitation in Säugerzellen nachgewiesen werden. Dieses Resultat hat besondere Relevanz da für die CH Domäne des Mikrotubuli-bindenden Proteins EB1 eben jenes Modul als Sitz der Bindungsstelle an Mikrotubuli identifiziert wurde. Diese Untersuchungen unterstützen unsere Ansicht, dass CH Domänen als potenzielle Verankerungsmodule für das Aktin, aber auch das Mikrotubuli Zytoskelett fungieren, und somit diese beiden Zytoskelettsysteme miteinander vernetzen können. Für das Aktin-bindende Protein SM22 konnte eine Y2H Interaktionen mit dem LIM Domänen Protein CRP2 eindeutig nachgewiesen werden Diese Wechselwirkung wurde ebenfalls durch Immunpräzipitation, und weiters durch direkte Protein-Protein-Wechselwirkung in vitro belegt. Beide Protein co-lokalisieren am Aktin Zytoskelett und präzipitieren gemeinsam mit F-actin. Die Wechselwirkung von SM22 mit CRP2 verstärkt den Eindruck, dass SM22 eine mögliche Komponente des mechanosensorischen Komplexes in der Zelle sein könnte, und gemeinsam mit anderen Faktoren an der Regulation der glattmuskelspezifischen Genexpression beteiligt ist. Isolierte CH Domänen lokalisieren vornehmlich an spezialisierten Membranstrukturen die jenen, die bei der Bildung von endozytotischen Vesikeln entstehen, stark ähneln. Der gezielte Austausch von CH Domänen hat weiters unsere Hypothese unterstrichen, dass CH Domänen aus funktions-unverwandten Proteinen nicht funktionell gegeneinander ausgetauscht werden können. Wurde z.B. die CH Domäne des Nukleotidaustauschfaktors Vav gegen jene des Aktin-bindenden Proteins Calponin ausgetauscht, so ging die in der CH Domäne von Vav liegende Regulation verloren. In weiteren Untersuchungen ist es uns darüberhinaus gelungen jene Region die für die funktionelle Plastizität der Typ3 CH Domänen verantwortlich sein dürfte in dem Abschnitt welcher die beiden Helices am N-terminalen Ende miteinander verknüpft einzugrenzen. Ein gezielter Austausch dieser kurzen Region verursachte den gleichen Effect wie der Austausch der gesamten CH Domäne. Durch die Herstellung einer Fusionsmutante konnten wir weiters belegen, dass die negativ regulatorische Funktion der CH Domänen, ungeachtet ihrer molekularen Herkunft auch in den Proteinen des Aktin Zytoskelettes vorhanden ist. Fusion der Calponin CH Domäne auf das verwandte, aber CH Domänenlose Protein UNC-87 aus C. elegans reduzierte dessen Bindungsaktivitäten für F-Actin auf Werte die mit jenen von Calponin vergleichbar waren. In Abwesenheit der CH Domäne lagen die Werte hingegen um ein 4 bis 8-faches höher. Die Ergebnisse aus diesem Forschungsprojekt haben mit dazu beigetragen das Konzept der "Protein Linguistik" weiter zu stützen. Die unter diesem Begriff sich rasch entwickelnde Forschungsrichtung verfolgt die Hypothese, dass sich die funktionelle Plastizität von Proteinen durch die Verwendung von stabilen Modulen die strukturell eng miteinender verwandt sind im Zuge der Evolution fortgesetzt hat.