Genexpressionsmuster nach PDT

Um Mechanismen der Zellantwort auf photodynamische Behandlung mit durch Aminolevulin-Säure gebildetem Protoporphyrin IX zu erklären und damit die Therapie zu verbessern, soll die Modulation der Genexpression nach Behandlung der menschlichen Tumorzelllinie A-431 mittels High-Density-cDNA-Array untersucht werden. Die Photodynamische Tumortherapie (PDT) ist ein vielversprechender neuer Ansatz in der Tumorbehandlung. Er beruht auf der bevorzugten Aufnahme und Speicherung eines Photosensibilisators in Tumoren und in der Produktion reaktiver Sauerstoffarten (ROS) während der Bestrahlung des im Tumorareals angereicherten Photosensibilisators mit sichtbarem Licht. Der entstehende primäre Tumorschaden beruht größtenteils auf der direkten Zerstörung der neoplastischen Zellen. Die PDT zeichnet sich sowohl durch hohe Tumorspezifität, als auch durch geringe Nebenwirkungen im Gegensatz zu Strahlen- oder Chemotherapie aus. Der Photosensibilisator Protoporphyrin IX (PpIX), endogen durch die Vorläufer-Substanz Aminolevulin-Säure (ALA) im Häm-Biosyntheseweg gebildet, kann - angereichert durch externe Gabe von ALA - in verschiedenen klinischen Bereichen eingesetzt werden. Obwohl bis jetzt sehr ermutigende Resultate der ALA-PDT berichtet wurden, ließe sich die Therapie noch verbessern, wenn mehr Information über die grundlegenden Mechanismen, die die offensichtlich zellulären Effekte und den Heilerfolg bewirken, zur Verfügung stände. Ziel des vorliegenden Projektes ist es daher, in einem detaillierten, umfassenden und vernetzten Ansatz die Modulation der Genexpression nach photodynamischer Behandlung mit ALA/PpIX und vermittelt durch ROS, zu analysieren. Die Plattenepithelkarzinom-Zelllinie A-431 soll als menschliches Tumorzellmodell verwendet werden. Hauptsächliche Untersuchungsmethode soll eine Expressionsanalyse unter Verwendung von High-Density-cDNA- Arrays sein, wie wir sie bereits in vorläufigen Versuchen einsetzten. cDNAs aus Kontroll- und PDT-behandelten Zellen werden mit Filtern hybridisiert, auf denen sich PCR-Fragmente befinden, die etwa 30000 verschiedene menschliche Transkripte repräsentieren. Differentiell exprimierte Gene werden mittels Datenanalyse-Programm identifiziert und durch Northern-Blot-Analyse oder Sub-Arrays mit ausgewählten Kandidatengenen verifiziert. Beruhend auf unseren vorläufigen Untersuchungen erwarten wir, Gene zu finden, die schon im Zusammenhang mit PDT beschrieben wurden, weiters bekannte Gene ohne bisherige Erwähnung in der PDT und neue Gene mit unbekannter Funktion.

Die Analyse der Änderungen im Genexpressionsmuster der menschlichen Karzinom-Zelllinie A-431 zu verschiedenen Zeitpunkten nach photodynamischer Behandlung mit endogenem Protoporphyrin IX konnte mittels cDNA-Array Technik zeigen, daß die durch PDT erzeugte Nekrose nicht nur ein passives Ereignis ist, sondern durch eine beträchtliche Änderung im Genexpressionsmuster begleitet wird. Da Nekrose eine stark immunstimulierende Wirkung zeigt, könnten die vorliegenden Resultate eine Auswirkung auf die Patientenbehandlung haben. Die Photodynamische Therapie (PDT) stellt eine relativ neue Art der Behandlung maligner und nicht-maligner Erkrankungen dar. Trotz ermutigender klinischer Ergebnisse sind die grundlegenden, zum Zelltod führenden Mechanismen noch nicht ganz geklärt. Wir setzten uns deshalb zum Ziel, die Änderungen im Genexpressionsmuster der menschlichen Plattenepithel-Karzinom-Zelllinie A-431 zu verschiedenen Zeitpunkten nach photodynamischer Behandlung mit endogenem PpIX mittels cDNA-Array Technik zu analysieren. Dadurch erwarteten wir, Expressions-kinetiken für einen weiten Bereich von Genen erhalten, die in Krebsentstehung, Proliferation, Stress-Antwort und Signalübertragung eine Rolle spielen. Die Zellen wurden entsprechend einem optimalen Protokoll behandelt, das genügend intakte mRNA für die Analyse ermöglicht. Die RNA wurde 1.5, 3, 5 und 8 Stunden nach Behandlung, einschließlich der Kontrollen, isoliert, durch reverse Transkription mit 33P-dCTP radioaktiv markiert und auf Makro-Array PCR Filter mit PCR-Produkten von 2135 verschiedenen Genen hybridisiert. Die Bestätigung der beobachteten Änderungen von interessierenden Genen wurde mittels Real-Time PCR durchgeführt. Aufgrund des hauptsächlich nekrotischen Zelltodes während ALA-PDT (Apoptose-negativ in Assays) fanden wir nur zwei Gene mit hoch-regulierter Expression im Vergleich zu der unbehandelten Kontrolle: die Stress-Antwort-Gene c-fos und c-jun (Hochregulierung innerhalb 1.5 - 8 Stunden nach Bestrahlung; maximal 217-fach bei 1.5 St., bzw. 52-fach bei 8 St.). Die Menge der nieder-regulierten Gene zeigte einen starken Anstieg mit der Zeit nach Behandlung, wenn man die Array Ergebnisse alleine betrachtet: 1 Gen nach 1.5 Stunden, 10 Gene nach 3, 60 nach 5 und 107 nach 8 Stunden. Mittels Quantifizierung durch Real-Time PCR konnten 10 von 15 ausgewählten nieder-regulierten Genen bestätigt werden. Unter diesen Genen befindet sich das Zellanheftungs-Gen fibronectin, was ein aktives Loslösen als Folge von PDT-Stress nahelegt, weiters die Proliferations- und Zellzyklus-unterstützenden Gene proliferating cell nuclear antigen (PCNA), CDC-like kinase 2 (CLK2), retinoblastoma 1 (RB1) und cell division cycle 2(G1 to S and G2 to M) (CDC2), was auf eine aktive Verlangsamung der Proliferation weist, und schließlich die Apoptose-induzierenden Gene c-myc und Fas- associated via death domain (FADD), was auf eine mögliche Umgehung apoptotischer Signalübertragungswege hindeutet.