Rekonstitution der Cadherin-Funktion

Die Entwicklung eines Embryos beruht auf fortschreitender Differenzierung, Umgruppierung und Organisation aller beteiligten Zellen. Eine vorrangige Role spielen dabei die direkten Zell-Zell-Kontakte über "Cadherine" (Calcium-abhängige Adhäsionsproteine). Diese 2 nm dicken Faden-proteine ragen 20 nm weit aus der Zellmembran und gehen mit den Cadherinen der angrenzenden Zelle spezifische Haftverbindungen ein. Es gibt knapp 20 klassische Cadherine, starke Haftungen geben aber immer nur Cadherine des gleichen Typs. Eine Epithelzelle wird z.B. über ihre E-Cadherine spezifisch im Verband eines Epithels festgehalten und eine epitheliale Tumorzelle kann nur dann metastasieren, wenn es ihr gelingt, ihre E-Cadherine funktionell abzuschalten. Fehlerhafte Cadherinfunktionen zeichnen auch für andere pathologische Vorgänge verantwortlich. Leider ist noch nicht bekannt, über welchem Mechanismus und mit welcher Geometrie sich die "Cadherin-Finger" zweier Zelloberflächen zusammenschließen. Die Haftstrukturen sind zu klein für die Elektronenmikroskopie und zu groß für die Kristallstrukturanalyse. Im gegenständlichen Projekt werden in einem Atomkraftmikroskop 1, 2, 4 oder 8 Cadherin-moleküle über ein entsprechend gegabeltes Polymermolekül an einen Punkt einer Goldoberfläche gekoppelt und aus der Lösung eine gleichartige flexible Gabel mit 1, 2, 4, oder 8 Cadherin-molekülen herangeführt. Die Messung von Kraft-Abstands- Zyklen soll zeigen, ob die Haftung nur über die "Fingerspitzen" erfolgt oder durch eine komplette Überlappung der antiparallelen Cadherinfinger, ob sich reißverschlußartige Strukturen bilden - und welche Teile der Cadherin-finger einander tatsächlich berühren. In der zweiten Projektetappe wird die Anordnung der Cadherine auf der Goldoberfläche jener auf einer lebenden Zelle maximal angenähert und die Bindung von definierten Cadherinbündeln optisch verfolgt. In der dritten Etappe wird diese molekulare Situation auf lebende Zellen übertragen, welche das gewünschte Cadherin exponieren, und die Bindung ebenfalls optisch verfolgt. Das Ziel ist ein detailliertes Verständnis der Cadherin-funktion, als rationale Grundlage für therapeutische Ansätze und ganz allgemein zum Schließen einer bedeutenden zellbiologische Wissenslücke.

Lebende Zellen bestehen aus Biomolekülen, welche einenander paarweise oder in Gruppen erkennen und langfristig oder vorübergehend festhalten, wodurch sowohl dauerhafte Strukturen als auch rasche Prozesse ermöglicht werden. Dei Kräfte dieser Wechselwirkungen können im Kraftmikroskop an einzelnen Molekülen unter Einfluss dritter Komponenten gemessen werden. Dabei ergibt sich ein detailliertes Bild vom Mechanismus und der Regulation der Wechselwirkung. In der Praxis wird eines der beiden Moleküle mit einer dünnen Polymerkette an die Mess-Spitze des Kraftmikroskops geheftet und das komplementäre Partnermolekül in ähnlicher Weise an eine glatte Oberfläche gebunden. Die Moleküle werden oft in Kontakt gebracht und wieder getrennt, um die Kräfte und Streckungsbewegungen genau auszumessen. Im konkreten Forschungsprojekt wurde die Methode des "Anseilens" von Proteinen an die Mess-Spitze stark vereinfacht und verbessert, wodurch 98% des Proteinbedarfs eingespart wurden. Außerdem wurde der Mechanismus der Proteinkopplung genau untersucht und mit analogen Reaktionen in wässriger Lösung verglichen. Das erstaunliche Resultat: Auf der Mess-Spitze koppelt ein Protein ca. 10000 Mal schneller als in reiner Lösung. M.a.W. es gibt einen bislang unbekannten Helfer, welcher dafür sorgt, dass die Kopplung an die Mess-Spitze nur 1 Stunde dauert und nicht einige Monate! Dieser Helfer ist die Voradsorption von Protein am Ort der Kopplung, wobei das Protein von 0,01 % auf fast 100 % angereichert wird. Die Studien wurden auf Biosensoren und Biochips ausgeweitet und auch hier wurde die Voradsorption als der wichtigste Faktor für die rasche Besetzung mit Sensormolekülen identifiziert. Bei Biosensoren und Biochips werden nicht-adsorptive Oberflächen stark bevorzugt, wodurch auch die Kopplung der Sensormoleküle stark erschwert ist. Glücklicherweise konnten einige besonders schnelle Kopplungsreaktionen gefunden werden, welche die Hilfe der Voradsorption nicht benötigen. Die zuletzt beschriebenen Arbeiten wurden auf Goldoberflächen durchgeführt, welche mit einem dichten Rasen von ganz kurzen Kettenmolekülen bedeckt sind. Jedes Kettenmolekül besitzt an einem eine ein Schwefelatom, welches heftig ans Gold bindet, während das wasserseitige Segment der Kettenmoleküle Proteine stark abweist. Ein Teil der wasserseitigen Enden trägt eine reaktive Gruppe, welche sehr robust ist aber nur langsam Protein koppelt. Auf Wunsch kann diese Gruppe binnen Minuten in beliebige andere (schnelle!) Kopplungsgruppen umgewandelt werden. Das spezielle Design dieser Kettenmoleküle wurde zum Patent angemeldet (A1469/2006).