Einbau von CA2+ Kanälen in Synapsen von Hippocampus Neuronen

Im zentralen Nervensystem spielen Ca2+ Kanäle eine bedeutende Rolle in der Leitung, synaptischen Übertragung und Integration von elektrischen Signalen. Um all diese Funktionen zu erfüllen, exprimieren Neurone eine Vielfalt von Ca2+ Kanälen in unterschiedlichen Membrankompartimenten, wie z.B. in prä- und postsynaptischen Membranen. Dies erfordert zelluläre Mechanismen für den Transport und gezielten Einbau der Ca2+ Kanäle in die spezifischen Zielmembranen. Da diese sogenannten Targeting-Mechanismen für Ca2+ Kanäle in Neuronen noch unbekannt sind, beabsichtigen wir in diesem Projekt die differentielle Verteilung von Ca2+ Kanälen in Hippocampusneuronen zu untersuchen und die Targeting-Signale in der Primärstruktur von Spannungs-aktivierten Ca2+ Kanälen zu identifizieren. Spannungs-aktivierte Ca2+ Kanäle sind eine Familie von Proteinen mit ähnlicher Struktur und Aminosäuresequenz. Wenn zwei Vertreter dieser Proteinfamilie in unterschiedliche neuronale Kompartimente eingebaut werden, muss die Information für das unterschiedliches Targeting solcher Kanalisoformen in ihren nicht-homologen Sequenzen enthalten sein. Diese Targeting-Signale lassen sich untersuchen, indem man in Hippocampusneuronen Kanal- Chimären (bestehend aus Teilen zweier Isoformen mit verschiedenen Targeting-Eigenschaften) exprimiert, und untersucht, welcher der beiden Kanalteile das Targeting-Verhalten der Chimäre bestimmt. Dieses Forschungsvorhaben beinhaltet folgende Schritte: (1) Die Etablierung eines neuronalen Zellkultursystems für die heterologe Expression von Ca2+ Kanälen und die Untersuchung ihrer Targeting-Eigenschaften. (2) Die Charakterisierung der subzellulären Verteilung endogener Ca2+ Kanäle in kultivierten Hippocampusneuronen. (3) Die Analyse der Targeting-Eigenschaften heterolog exprimierter Kanalisoformen in diesen Neuronen. (4) Die Herstellung und Expression von Kanal-Chimären, und die Identifizierung des Targeting-Signals durch schrittweise Einschränkung der kritischen Sequenz, sowie durch Mutation individueller Aminosäuren des putativen Targeting- Motivs. (5) Die Übertragung der Targeting-Information von einem Ca2+ Kanal auf ein einfacheres Membranprotein; und schließlich (6) die Identifizierung des Bindungspartners, der den Kanal in der Zielmembran verankert. Die exakte Lokalisation spezifischer Ca2+ Kanäle in Neuronen und die Entschlüsselung der Mechanismen des gezielten Einbaus dieser Kanäle in synaptische Membranen, sind wichtige Fragen der zellulären Neurobiologie. Sie zu beantworten bedeutet einen wichtigen Beitrag zu unserem Verständnis, wie ein Second Messenger - Ca2+ - gleichzeitig so viele verschiedene Funktionen in unserem Nervensystem erfüllen kann.