Neuronale Funktion des Ubiquitin-Proteasom-Stoffwechselweges

Im vorliegenden Forschungsprojekt werden die morphologischen Grundlagen neuronaler Differenzierung und axonalen Wachstums peripherer Nervenzellen untersucht. Mittels moderner molekularbiologischer Verfahren wurden in allgemein anerkannten Zellkulturmodellen die Wirkungen des Nervenwachstumsfaktors NGF auf die Genexpression analysiert und eine Reihe von bisher im Nervensystem noch wenig erforschten Genen gefunden, die dem Ubiquitin/Proteasom-Stoffwechselweg zugeordnet werden können. Es soll die genaue Regulation dieser Gene, die für Ubiquitin-konjugierende Enzyme und proteasomale Untereinheiten kodieren, untersucht und ihre Wirkung auf den neuronalen Phänotyp mittels Transfektion von Phäochromocytom-Zellen und sympathischen Neuronen studiert werden. Zudem ist das Vorkommen dieser Proteine im adulten Gehirn und während der Entwicklung des Nervensystems bisher noch völlig unbekannt. Die Ergebnisse der beantragten Experimente werden dazu beitragen, die Rolle der nicht-lysosomalen Proteindegradation im Nervensystem besser zu verstehen. Weiterhin können sie neue therapeutische Angriffspunkte für die Behandlung degenerativer oder traumatischer Erkrankungen des Nervensystems darstellen.

Neuronale Tumorzellen (PC12) stellen ein geeignetes Modell zur Untersuchung der molekularen Mechanismen neuronaler Differenzierung und axonalen Wachstums dar. Wir haben mittels differentieller Display-PCR (DD- PCR) und serieller Analyse der Genexpression (SAGE) das mRNA-Profil von PC12-Zellen nach Behandlung mit verschiedenen Wachstumsfaktoren analysiert. Dabei wurden mehrere Gene identifiziert, die unterschiedliche Aspekte neuronaler Morphologie kontrollieren. Die Ergebnisse unserer Untersuchungen zeigen, daß die Regulation des Ubiquitin/Proteasom-mediierten Proteinabbaus einen Mechanismus darstellt, über den Neuritenwachstum gesteuert wird. Ubiquitin ist ein 76 Aminosäuren langes Peptid, das als Markermolekül verwendet wird, um in der Zelle nicht mehr benötigte oder geschädigte Proteine dem Proteasom zuzuführen. In diesem aus vielen Untereinheiten zusammengesetzten Molekül werden die Eiweisse dann proteolytisch gespalten und damit inaktiviert. Wir haben im Rahmen der Genexpressionsstudien ein Ubiquitin-konjugierendes Enzym (HR6) und eine katalytische Proteasom- Untereinheit (ß5) detektiert. Das Ziel dieses Projektes war es, die in der neuronalen Zellinie erhobenen Befunde in primär neuronalen Systemen mittels verschiedener Techniken zu verifizieren und die funktionelle Bedeutung dieser beiden regulierten Gene zu eruieren. Das Expressionsmuster von HR6 wurde im Nervensystem und in verschiedenen anderen Organen mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers untersucht. Seine Regulation durch Wachstumsfaktoren wurde analysiert, und die funktionelle Rolle dieses Enzyms im Rahmen der neuronalen Differenzierung und während des axonalen Wachstums mittels moderner molekularbiologischer Untersuchungsmethoden identifizert. Die katalytischen Untereinheiten des Proteasoms, die molekularen Scheren`, wurden hinsichtlich Regulation und physiologischer Relevanz ebenfalls intensiv untersucht. Unter Verwendung pharmakologischer Inhibitoren konnte die hervorragende Bedeutung des Proteasoms für die verschiedenen Aspekte axonaler Regeneration - Inititation, Elongation und Stabilisierung - aufgezeigt werden. Zusammengenommen haben wir im Rahmen dieses Projekts begonnen, den bisher im Nervensystem noch weitgehend unerforschten Proteinabbau durch das Ubiquitin-Proteasom-System besser zu verstehen. Damit können sich neue Ansätze zur molekularen Therapie von degenerativen und traumatischen neurologischen Erkrankungen ergeben.