Regulierung des L-Typ Ca2+Kanals durch Calmodulin

Spannungs-abhängige Kalzium Kanäle sind Poren-bildende Membranproteine, die essentiell für eine Reihe physiologischer Funktionen sind. Die Aktivität von L-Typ Kalzium Kanälen wird durch den Einstrom von Kalzium reguliert. Dieses Projekt zielt darauf ab, den molekularen Mechanismus einer Calmodulin (CaM)-Wirkung für die Kalzium-abhängige Inaktivierung von Klasse C-Typ Kalzium Kanälen quantitativ zu verstehen. Elektrophysiologische Methoden und die Atomkraft-Mikroskopie werden dabei eingesetzt. Hierbei werden Parameter von Ganzzellen- und insbesondere Einzelkanalströmen mit Einzelmolekül-Interaktionskräften korreliert. Während die Ca2+ abhängige Bindung von CaM an ein IQ CaM Bindemotiv im Carboxyterminus von alpha1C schon ausreichend studiert wurde, bleibt die Funktion der kürzlich entdeckten CaM-Bindungsstelle bei Ca2+ im Ruhezustand der Zelle wenig dokumentiert. Die funktionelle Bedeutung dieser CaM Binderegion (CBR) wird elektrophysiologisch studiert. Dazu werden entweder Peptide entsprechend der CBR, oder alpha1C Untereinheiten mit Veränderungen in der CBR verwendet, von denen erwartet wird, daß sie die Ca2+ induzierte Inaktivierung stören. Die Resultate werden mit jenen aus der Atomkraft-Mikroskopie der entsprechenden Carboxyterminus- Proteine korreliert. Hier werden Wechselwirkungskräfte von CaM mit der CBR und dem IQ Motiv in Abhängigkeit der Ca2+/CaM Konzentration bestimmt. Weiters werden Konformationsänderungen der Carboxyterminus-Proteine, die durch Ca2+/CaM ausgelöst werden, gemessen. Das Studium der Mechanik der Proteine wird weitere strukturelle Details enthüllen. Calmodulin-Mutanten mit intakten EF Domänen, allerdings mit veränderter, struktureller Interaktion des N-terminalen und des C-terminalen Endes, werden auf ihre dominant, negative Wirkung auf die Ca2+ induzierte Inaktivierung untersucht. Interaktionskräfte dieser CaM-Mutanten mit CBR und dem IQ Motiv werden mit den elektrophysiologischen Ergebnissen verglichen, um einen molekularen Einblick in einen potentiellen inhibitorischen Effent zu erzielen. Ergänzend dazu werden Domänen und Unterregionen des CaM, die mit CBR und IQ Motiv interagieren, weiter charakterisiert und die Interaktionskräfte ermittelt. Zusätzlich wird auch die Interaktion von intrazellulären Domänen des Kanals, die auch andere CaM Bindemotive enthalten, mit dem Carboxyterminus bestimmt. Diese Interaktion erfolgt möglicherweise über CaM und vermittelt die Ca2+ induzierte Inaktivierung. Ein anderes mutmaßliches IQ CaM Bindemotiv, das in der beta-Untereinheit entdeckt wurde, wird hinsichtlich seiner Rolle bei der Modulation der Ca2+ abhängigen Inaktivierung untersucht. Fluoreszenzmarkierte Komponenten werden zusätzlich verwendet um in vitro Interaktionen von alpha1C mit CaM sichtbar zu machen.

Spannungs-abhängige (L-Typ) und nicht-spannungs-abhängige (TRPV6) Kalzium Kanäle sind Poren-bildende Membranproteine, die essentiell für eine Reihe physiologischer Funktionen sind. Die Aktivität von diesen Kalzium Kanälen wird durch den Einstrom von Kalzium reguliert. Dieses Projekt zielt darauf ab, die molekularen Mechanismen einer Calmodulin (CaM)-Wirkung für die Kalzium-abhängige Inaktivierung von beiden Kalzium Kanal Typen quantitativ zu verstehen und zu vergleichen. Elektrophysiologische Methoden, Atomkraft- und Fluoreszenz-Mikroskopie sowie Oberflächen Plasmon Resonanz (Biacore) werden dabei eingesetzt. Die Interaktion von CaM mit dem L-Typ (Cav 1.2) Ca2+ Kanal wurde zu Beginn mittels Biacore etabliert und dann auf Atomkraft-Mikroskopie ausgedehnt, wobei diese Interaktion an His6-markierten C-terminalen Fragmenten der alpah1 Untereinheit des Ca2+-Kanals charakterisiert wurde. Hierfür wurde eine neue funktionelle Oberfläche entwickelt, die auf der kovalenten Bindung einer selbst-assemblierenden Monoschicht, welche NTA- Thiole beinhaltet, beruht. Dies ermöglichte nun die spezifische, orientierte und funktionelle Binding des His6- markierten C-terminus des Ca2-Kanals sowie die Charakterisierung dessen Ca2+-abhängiger Interaktion mit CaM auf der Ebene von einzelne Molekülen. Diese Methodik wurde auch erfolgreich auf die Untersuchung der Membranwechselwirkung von Beta-Glykoprotein 1 angewandt. Die Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer Mikroskopie, die ermöglicht, die Interaktion zweier Proteine in lebenden Zellen sichtbar zu machen, wurde an Hand der beta-spezifischen Modulation des Ca2+-Kanal Schaktverhaltens etabliert. Auf dieser Basis wurden in folge die Ca2+/CaM-abhängige Inaktivierung des TRPV6 Ca2+-Kanals mit der des L-Typ (Cav 1.2) Kanals genauestens verglichen. Hierbei wurden deutlich unterschiedliche Inaktivierungsmechanismen gefunden. Dies diente in der Folge auch dazu, den Mechanismus der Inaktivierung eines anderen L-Typ (Cav 1.4) Ca2+ Kanals zu untersuchen, da eine Mutation dessen alpah1- Untereinheit Nacht-Blindheit Typ 2 verursachen kann.