Struktur-Funktionsbeziehungen in Katalase-Peroxidasen

Peroxidasen katalysieren die vielfältigsten biochemischen Reaktionen. Neben der Entsorgung von toxischen Peroxiden in der Zelle sind sie an der Lignin Biosynthese (einem der häufigsten Biopolymere der Erde), an der unspezischen Immunabwehr des Menschen oder beispielsweise an Hormonbiosynthesen (z.B. in der Schilddrüse) beteiligt. Peroxidasen der Klasse I der Superfamilie I (dazu gehören Enzyme aus Bakterien, Pilzen und Pflanzen) sind äußerst interessante Studienobjekte der Enzymologie. Zu Klasse I Peroxidasen gehören bakterielle Katalase- Peroxidasen, Cytochrom c Peroxidase aus Hefe und Ascorbat Peroxidasen aus Pflanzen. Trotz sehr hoher Aminosäurehomologie zeigen diese 3 Vertreter hinsichtlich ihrer Reaktivität jedoch sehr starke Unterschiede. Die gemeinsame Funktion ist zwar die Entsorgung des intrazellulär gebildeten toxischen Wasserstoffperoxids, jedoch benötigt Cytochrom c Peroxidase dazu als Elektronendonor ein Protein (Cytochrom c), während Ascorbat Peroxidasen die Wasserstoffperoxid Reduktion mittels des hydrophilen Anions Ascorbinsäure durchführen. Und Katalase-Peroxidasen scheinen (und damit sind sie einzigartig unter Peroxidasen) Wasserstoffperoxid ähnlich den typischen Katalasen mit Hilfe eines weiteren Peroxid Moleküls unter Freisetzung von Wasser und Sauerstoff zu entsorgen. Daneben zeigen sie aber auch typische Peroxidase Aktivitäten und können hydrophobe aromatische Verbindungen oxidieren. Sie sind also bifunktionell (daher die Bezeichnung Katalase-Peroxidasen). Aufgrund dieser unterschiedlichen Reaktivität trotz hoher Homologie sind Klasse I Peroxidasen zur Untersuchung von Struktur-Funktionsbeziehungen optimal geeignet. Da der Mechanismus ihrer katalytischen Aktivität bislang unbekannt ist, werden in diesem Projekt rekombinante Proteine aus drei verschiedenen Bakterien untersucht. Durch ortsspezifische Mutagenese in Kombination mit verschiedenen spektroskopischen Methoden (UV-Vis Spektroskopie, Resonanz Raman Spektroskopie, Elektronen Spin Resonanz Spektroskopie) und kinetischen Untersuchungsmethoden (Multi-mixing Stopped-flow Spektroskopie, Polarographie) soll der Reaktionsmechanismus aufgeklärt werden und ein wertvoller Beitrag zum Verständnis von Hämproteinen (zu denen neben Peroxidasen auch Katalasen, Myoglobin, Hämoglobin, Cytochrome und viele andere im Stoffwechsel sehr wichtige Enzyme zählen) geleistet werden. Insbesondere ermöglichen diese Untersuchungsmethoden die Charakterisierung der Struktur und Reaktivität der Redoxintermediate dieser metallhältigen Enzyme und das Verständnis der Rolle der Aminosäuren der Proteinmatrix an der Substratbindung und -oxidation, am Elektronentransport zur prosthetischen Hämgruppierung und an der Wasserstoffperoxid Reduktion (und bei Katalase Aktivität auch Wasserstoffperoxid Oxidation). Da die dreidimensionale Struktur dieser Enzyme bislang unbekannt ist, sind zudem umfangreiche Kristallisationsversuche geplant.

Peroxidasen katalysieren die vielfältigsten biochemischen Reaktionen. Neben der Entsorgung von toxischen Peroxiden in der Zelle sind sie an der Lignin Biosynthese (einem der häufigsten Biopolymere der Erde), an der unspezischen Immunabwehr des Menschen oder beispielsweise an Hormonbiosynthesen (z.B. in der Schilddrüse) beteiligt. Peroxidasen der Klasse I der Superfamilie I (dazu gehören Enzyme aus Bakterien, Pilzen und Pflanzen) sind äußerst interessante Studienobjekte der Enzymologie. Zu Klasse I Peroxidasen gehören bakterielle Katalase- Peroxidasen, Cytochrom c Peroxidase aus Hefe und Ascorbat Peroxidasen aus Pflanzen. Trotz sehr hoher Aminosäurehomologie zeigen diese 3 Vertreter hinsichtlich ihrer Reaktivität jedoch sehr starke Unterschiede. Die gemeinsame Funktion ist zwar die Entsorgung des intrazellulär gebildeten toxischen Wasserstoffperoxids, jedoch benötigt Cytochrom c Peroxidase dazu als Elektronendonor ein Protein (Cytochrom c), während Ascorbat Peroxidasen die Wasserstoffperoxid Reduktion mittels des hydrophilen Anions Ascorbinsäure durchführen. Und Katalase-Peroxidasen entsorgen (und damit sind sie einzigartig unter Peroxidasen) Wasserstoff-peroxid ähnlich den typischen Katalasen mit Hilfe eines weiteren Peroxid Moleküls unter Freisetzung von Wasser und Sauerstoff. Daneben zeigen sie aber auch typische Peroxidase Aktivitäten und können hydrophobe aromatische Verbindungen oxidieren. Sie sind also bifunktionell (daher die Bezeichnung Katalase-Peroxidasen). Aufgrund dieser unterschiedlichen Reaktivität trotz hoher Homologie sind Klasse I Peroxidasen zur Untersuchung von Struktur- Funktionsbeziehungen optimal geeignet. In diesem Projekt konnte nun gezeigt werden, dass Katalase-Peroxidasen aussergewöhnliche strukturelle Eigenschaften aufweisen, die bislang in Peroxidasen nicht entdeckt wurden. So findet man im aktiven Zentrum beispielsweise ungewöhnlich vernetzte Addukte, deren Intaktheit für die erwähnte Katalase Aktivität essentiell ist. Durch ortsspezifische Mutagenese (es wurden mehr als 35 Aminosäuren ausgetauscht) und die Anwendung zahlreicher hochmoderner spektroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, wie ein ausgedehntes Wasserstoffbrückennetz im Protein zur Entstehung von stabilen Proteinradikalen führen kann, die im Reaktionsmechanismus eine Rolle spielen, und wie Wasserstoffperoxid mit Hilfe dieses Netzwerks in das aktive Zentrum geleitet wird. Die vorliegende Arbeit lieferte wichtige neue Erkenntnisse zum Elektronentransport in Redoxenzymen.