Protein Drg1 in Hefe

Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae eignet sich hervorragend zur Untersuchung der molekularen Mechanismen, die zur Bildung und zum Zerfall von messenger RNAs führen. Nach deren Entstehung durch Transcription im Zellkern erfolgt dort auch die Reifung der mRNAs, indem im 3`-nichttranslatierten Bereich eine endonukleolytische Spaltung, gefolgt von einer Poly-adenylierung der entstandenen 3`-Enden, stattfindet. Gleichzeitig wird am 5`-Ende die "Cap-Struktur" ankondensiert. Die reifen mRNAs werden als RNP-Partikel durch die Kernporen in das Cytoplasma transportiert, wo sie entfaltet und mit dem Translationssystem verbunden werden. Im Zuge der Translation wird ein System für die Überprüfung der Qualität der mRNA (NMD Pathway) wirksam, welches falsch zusammengesetzte RNAs einer Exonuklease zuführt, die für den Abbau der falschen RNAs sorgt. Behandlung von Hefezellen mit dem Hemmstoff Diazaborin führt nach unseren bisherigen Ergebnissen zum Auftreten von falschen mRNA Molekülen, die am 3`-Ende wesentlich länger waren. Resistenz gegen die wachstumshemmende Aktivität des Wirkstoffs entsteht durch Mutationen im Gen für das AAA-Protein Drg1. Diese Mutanten zeigten auch keine falschen und zu langen mRNAs nach Behandlung mit Diazaborin. Bei Untersuchungen im "Yeast Two Hybrid System" fanden wir Interaktionen von Drg1p mit vier verschiedenen Proteinen der Kernpore. Im vorliegenden Projekt soll die Funktion des Proteins Drg1 im mRNA Metabolismus geklärt werden. Die Grundlage für das Projekt ist die Arbeitshypothese, wonach Diazaborin die Zerlegung der RNP-Partikel und damit den Einsatz des Qualitäts-Kontrollsystems stört, und dass ferner das Protein Drg1 in diesem Prozeß, zusammen mit den Proteinen der Kernpore, für die Entfaltung der RNP-Partikel verantwortlich ist. Die wissenschaftlichen Fragestellungen sollen durch mehrere methodische Ansätze geklärt werden, wobei dem Einsatz von Hefemutanten eine besondere Bedeutung zukommen soll. Insbesondere sollen Mutanten in den Genen für die Proteine des RNP-Partikels, Mutanten der Proteine der Kernpore und Mutanten des NMD-Qualitäts- Kontrollsystems eingesetzt und deren Wechselwirkungen mit Mutationen im Gen DRG1 untersucht werden. Die Wechselwirkungen sollen mit den Methoden der Genfusion, der Synthetischen Letalität, und des Two Hybrid Systems studiert werden. Außerdem soll das Entstehen von falschen mRNA Molekülen in verschiedenen Mutanten mittels Northern-blotting und durch Polysomen-Analysen untersucht werden. Interessanterweise zeigte die YAP1- spezifische mRNA, wenn sie aus diazaborinbehandelten Hefezellen isoliert wurde, keine falschen und zu langen mRNA Moleküle. Wir wollen die Möglichkeit untersuchen, dass dieses spezifische Verhalten von YAP1-mRNA auf das Vorhandensein eines sogenannten uORF zurückzuführen ist, der dem Strukturgen vorangeht. Ein anderer Teil des Projektes soll sich mit dem Mechansimus der durch allelische Formen des Gens DRG1 ausgelösten Diazaborinresistenz widmen. In Vorversuchen fanden wir eine extrem hohe Halbwertszeit der DRG1-spezifischen mRNA. Der Mechanismus, der zu dieser hohen mRNA-Stabilität führt, soll untersucht werden.

Dia antibakteriell wirkende Substanz Diazaborin erwies sich auch als wirksam in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiea, einem einfachen Eukaryonten. Das Ziel der Arbeiten an diesem Projekt war es, den Wirkmechanismus von Diazaborin in der Hefe aufzuklären. Diazaborinresistente Mutanten aus einem Vorprojekt zeigten Veränderungen in einem Gen, welches als DRG1, bzw. AFG2, bezeichnet wird und für ein sogenanntes AAA- Protein codiert. Wegen dieses Zusammenhanges wurde auch die Frage nach der Funktion der Proteins Drg1 gestellt. Die Untersuchung der direkten Wirkung von Diazaborin auf Hefezellen zeigte eine massive Verarmung der großen ribosomalen Untereinheit. Eine detailliertere Überprüfung ergab, dass die Bildung der 25S ribosomalen RNA betroffen war und zwar im Verlaufe der Prozessierungskaskade an einem spezifischen Schritt, der auch genau identifiziert werden konnte. Die Funktion des Proteins Drg1 wurde mithilfe von temperatursensitiven Mutanten im Gen DRG1 untersucht. Wenn derartige Mutanten bei nichtpermissiver Temperatur gehalten wurden, zeigten sie einen Abfall im Gehalt an großen ribosomalen Untereinheiten. Eine genaue Nachuntersuchung zeigte auch hier, dass ein Defekt in der Reifung der 25S rRNA vorlag. Der betroffene Schritt in der Prozessierungskaskade war nicht derselbe, der von der Diazaborinwirkung herrührt sondern ist ein späterer. Das Protein Drg1 ist ausschließlich im Zytoplasma vorhanden. Um zu erklären, wie es zu einer Beeinflussung der im Kern ablaufenden rRNA Prozessierung kommt wird die Existenz eines am präribosomalen Partikel haftenden Proteins angenommen, welches durch Drg1p im Zytoplasma freigesetzt wird und danach wieder in den Kern wandert. In der temperatursensitiven Mutante wäre demnach die Freisetzung gestört. Wir haben gegenwärtig bereits ein derartiges Protein identifiziert und unternehmen Versuche um die Drg1-abhängige Freisetzung nachzuweisen. Hefestämme mit diazaborinresistenten Allelen im Gen DRG1 könnten leicht modifizierte Ribosomen produzieren, deren Funktion man in bestimmten Zuständen untersuchen kann. Es ist bekannt, dass veränderte Ribosomen zum starken Auftreten eines endogenen Hefevirus, genannt L-A, führen kann. Wir haben in gewissen DRG1- Mutanten das Vorhandensein dieses Virus nachweisen können, was einen Hinweis auf veränderte Ribsosomen darstellen könnte. Die Arbeit in diesem Projekt brachte nicht nur eine Klärung der Funktion eines bisher unbekannten Hefegens, sondern identifizierte auch ein neuartiges Target für Hemmstoffe in eukaryonten Zellen.