Analyse der Proteinglykosylierung an Einzelzellen

Viele Proteine, die von der biotechnologischen Industrie in rekombinanten Zellen hergestellt werden, sind Glykoproteine, deren Kohlenhydratanteil eine wichtige Funktion für die biologische Aktivität, für die Vermeidung einer unangemessenen Immunantwort oder die vorzeitige Entfernung der Proteine aus dem Blut durch die Leber erfüllt. Einige bekannte Beispiele sind Zytokine, Interferon, Antikörper, Erythropoietin und andere therapeutische Proteine. Solche Proteine müssen in tierischen Zellen hergestellt werden, da Bakterien nicht in der Lage sind, solche Kohlenhydratseitenketten herzustellen und Hefen nur eine primitive Vorstufe synthetisieren können. Mehrere Parameter beeinflußen die korrekte Glykosylierung solcher Proteine, darunter die Kulturbedingungen, die Zelltype und die Spezies der verwendeten Zellinie, die Gesamtprodukt-bildungsrate und vieles andere. Bisher wurde die korrekte Glycosylierung aus dem Kulturüberstand analysiert, mit Hilfe von HPLC oder MALDI- TOF Methoden. Normalerweise findet man dabei ein Muster von mehreren Isoformen, die mit sich ändernden Kulturbedingungen variieren können. Diese verschiedenen Isoformen können allerdings nicht mehr mit dem Status der sie produzierenden Zelle verknüpft werden. Mit Hilfe einer neuen Methode, bei der die von einer Zelle ausgeschiedenen Proteine an der Zelloberfläche abgefangen werden, ist es nun möglich solche Verknüpfungen herzustellen. Die Qualität der Glycosylierung von Proteinen kann dann mit Hilfe der Durchflusszytometrie an einzelnen, lebenden Zellen gemessen werden. Einsatzmöglichkeiten der Methode finden sich in der Analyse der Glykosylierungsqualität von Zellen unter verschiedenen Kulturbedingungen und in Bioreaktoren sowie in der Analyse verschiedener Subclone. Ziel dieser Arbeiten ist die Identifizierung von Kulturbedingungen und Zelleigenschaften, die für eine optimale Glykosylierung wichtig sind. Im zweiten Teil des Projektes sollen Zellen, die eine verbesserte Fähigkeit zur richtigen Glykosylierung von Proteinen haben, mit dem Zellsorter isoliert werden. Verglichen mit der gezielten Transfektion von Zellinien mit einzelnen Enzymen für die Synthese von Kohlehydratseitenketten erscheint dieser ganzheitliche Ansatz sehr vielversprechend.