Histon-Deacetylase HDA1 Komplexe in Mais

Die posttranslationale Modifikation von core-Histonen stellt ein wichtiges Element des sogenannten epigenetischen Histon-Codes dar, der die genetische Information der DNA funktionell verändert. Die am besten untersuchte Modifikation ist die Acetylierung von Histonen, die durch Histon-Acetyltransferasen und Histon-Deacetylasen katalysiert wird. Unser Labor konnte kürzlich über eine neue Ebene der Regulation von Histon-Deacetylasen berichten (Pipal et al., 2003), die darin besteht, dass die Aktivität eines Mais Homologs zu Hefe HDA1 durch limitierte proteolytische Prozessierung reguliert wird. Mais HDA1 wird als 84 kD Protein exprimiert, wobei dieses Protein keine enzymatische Aktivität besitzt, sondern durch einen spezifischen proteolytischen Prozessierungsschritt in ein enzymatisch aktives 48 kD Protein und ein kleines C-terminales Protein gespalten wird. Nur das enzymatisch aktive p48 war in der Lage, die Transkription in Reporter-Assays effizient zu reprimieren. Der 84 kD Vorläufer und das kleine C-terminale Spaltprodukt, welches ein Molekulargewicht von ~36 kD in der SDS-PAGE aufweist, kommen beide auch in hochmolekularen Komplexen vor, deren Zusammensetzung und Funktion unbekannt sind. Interessanterweise gibt es in Arabidopsis ein hoch verwandtes HDA1 Protein, zusätzlich dazu aber ein eigenes Gen, welches für ein kleines 252 AS Protein kodiert, welches hoch homolog zum C- terminalen Spaltprodukt des Maisenzyms ist. Auf Grund der Tatsache, dass das enzymatisch aktive Enzym (p48) nur einen kleinen Teil des insgesamt vorhandenen Mais HDA1 ausmacht, liegt es nahe, dass p84 und das proteolytische, C-terminale Spaltprodukt andere zelluläre Funktionen ausüben, zumal beide Proteine in hochmolekularen Komplexen vorkommen. Aus diesem Grund beschäftigt sich das vorliegende Projekt mit der Charakterisierung und Reinigung von enzymatisch inaktiven HDA1 Komplexen in Mais, mit dem Ziel Komplexpartner mittels Massenspektroskopie und Protein-Sequenzierung zu identifizieren, um so Rückschlüsse auf eine etwaige Funktion der beiden Proteine (p84 und das C-terminale Protein) ziehen zu können. Des weiteren widmet sich das Projekt der vermuteten Modifikation dieser HDA1-Formen, da schon länger bekannt ist, dass die Aktivität von p48 durch Phosphorylierung reguliert wird. Der dritte Teil des Projektes beschäftigt sich mit der Reinigung und Identifikation der Protease, die die spezifische Prozessierung von HDA1-p84 katalysiert, sowie mit Lokalisationsstudien der verschiedenen Formen in unterschiedlichen Mais-Geweben.

Die posttranslationale Modifikation von core-Histonen stellt ein wichtiges Element des sogenannten epigenetischen Histon-Codes dar, der die genetische Information der DNA funktionell verändert. Die am besten untersuchte Modifikation ist die Acetylierung von Histonen, die durch Histon-Acetyltransferasen und Histon-Deacetylasen katalysiert wird. Unser Labor konnte kürzlich über eine neue Ebene der Regulation von Histon-Deacetylasen berichten (Pipal et al., 2003), die darin besteht, dass die Aktivität eines Mais Homologs zu Hefe HDA1 durch limitierte proteolytische Prozessierung reguliert wird. Mais HDA1 wird als 84 kD Protein exprimiert, wobei dieses Protein keine enzymatische Aktivität besitzt, sondern durch einen spezifischen proteolytischen Prozessierungsschritt in ein enzymatisch aktives 48 kD Protein und ein kleines C-terminales Protein gespalten wird. Nur das enzymatisch aktive p48 war in der Lage, die Transkription in Reporter-Assays effizient zu reprimieren. Der 84 kD Vorläufer und das kleine C-terminale Spaltprodukt, welches ein Molekulargewicht von ~36 kD in der SDS-PAGE aufweist, kommen beide auch in hochmolekularen Komplexen vor, deren Zusammensetzung und Funktion unbekannt sind. Interessanterweise gibt es in Arabidopsis ein hoch verwandtes HDA1 Protein, zusätzlich dazu aber ein eigenes Gen, welches für ein kleines 252 AS Protein kodiert, welches hoch homolog zum C- terminalen Spaltprodukt des Maisenzyms ist. Auf Grund der Tatsache, dass das enzymatisch aktive Enzym (p48) nur einen kleinen Teil des insgesamt vorhandenen Mais HDA1 ausmacht, liegt es nahe, dass p84 und das proteolytische, C-terminale Spaltprodukt andere zelluläre Funktionen ausüben, zumal beide Proteine in hochmolekularen Komplexen vorkommen. Aus diesem Grund beschäftigt sich das vorliegende Projekt mit der Charakterisierung und Reinigung von enzymatisch inaktiven HDA1 Komplexen in Mais, mit dem Ziel Komplexpartner mittels Massenspektroskopie und Protein-Sequenzierung zu identifizieren, um so Rückschlüsse auf eine etwaige Funktion der beiden Proteine (p84 und das C-terminale Protein) ziehen zu können. Des weiteren widmet sich das Projekt der vermuteten Modifikation dieser HDA1-Formen, da schon länger bekannt ist, dass die Aktivität von p48 durch Phosphorylierung reguliert wird. Der dritte Teil des Projektes beschäftigt sich mit der Reinigung und Identifikation der Protease, die die spezifische Prozessierung von HDA1-p84 katalysiert, sowie mit Lokalisationsstudien der verschiedenen Formen in unterschiedlichen Mais-Geweben.