FRET und FCS Messungen der HRV/Rezeptor Interaktion

Die Röntgenstruktur eines Komplexes zwischen dem Schnupfenvirus HRV2 (humanes Rhinovirus Serotyp 2) und einem vom very-low density Lipoprotein Rezeptor (VLDLR) abgeleiteten Fragment, das die Bindungsrepeats 2 und 3 umfasst, zeigt, dass fünf Kopien des repeats 3 (V3) rund um die fünf-zählige Achse der icosahedrischen Symmetrie des Viruskapsids binden. Das repeat V2 ist nicht sichtbar und nimmt daher wahrscheinlich nicht an der Bindung Teil. Die N termini und die C-termini der benachbarten Module im Komplex sind etwa 10 Å voneinander entfernt was darauf hindeutet, dass fünf repeats innerhalb eines einzelnen Moleküls simultan binden können, wenn sie konkatemerisiert werden. Dies wird durch den Befund gestützt, dass artifizielle Konkatemere eine Zunahme des zellprotektiven Effektes mit der Anzahl der repeats im Molekül zeigen, wenn diese rekombinanten Proteine zusammen mit dem Virus zur HeLa Zellkultur zugegeben werden. Dieser Befund könnte bedeuten, dass die antivirale Wirkung auf eine Stabilisierung des Virus zurückzuführen ist indem die Freisetzung der genomischen RNA verhindert wird. Unsere Befunde führen auch zu der Frage ob die Interaktion des Virus mit den natürlich vorkommenden Membranproteinen, wie dem low-density Lipoprotein Rezeptor (LDLR) und dem LDLR-related Protein (LRP), über die Bindung mehrer Module innerhalb eines einzelnen Rezeptormoleküls erfolgt. Die Geometrie der Bindung solcher Moleküle soll mittels Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) Methoden untersucht werden. N-Terminus und C-Terminus artifizieller Konkatemere oder natürlicher Rezeptorfragmente werden dazu mit einem geeigneten FRET Paar markiert. Das Auftreten von FRET in der Gegenwart von Virus zeigt, dass C- und N-Termini innerhalb der Förster Distanz zu liegen kommen. Diese Studien werden durch Affinitätsmessungen an verschiedenen künstliche Konkatemeren und löslichen Fragmenten der natürlichen Rezeptoren mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektrometrie ergänzt. Die minimale, zur Viruserkennung erforderliche Struktur wird identifiziert und der Einfluss von Linker-Länge und Sequenz auf die Bindungsaffinität bestimmt werden. Es ist zu erwarten, dass durch Anpassung der Linker-Länge sehr effiziente Inhibitoren der Virusinfektion erhalten werden. Diese Studien erschließen die Grundlagen der Virusneutralization und führen zu einem besseren Verständnis der Prinzipien der Protein - Protein Interaktion. Sie könnten auch zu neuen Ansatzpunkten für die Herstellung von Virusinhibitoren führen.

Die Röntgenstruktur eines Komplexes zwischen dem Schnupfenvirus HRV2 (humanes Rhinovirus Serotyp 2) und einem vom very-low density Lipoprotein Rezeptor (VLDLR) abgeleiteten Fragment, das die Bindungsrepeats 2 und 3 umfasst, zeigt, dass fünf Kopien des repeats 3 (V3) rund um die fünf-zählige Achse der icosahedrischen Symmetrie des Viruskapsids binden. Das repeat V2 ist nicht sichtbar und nimmt daher wahrscheinlich nicht an der Bindung Teil. Die N termini und die C-termini der benachbarten Module im Komplex sind etwa 10 Å voneinander entfernt was darauf hindeutet, dass fünf repeats innerhalb eines einzelnen Moleküls simultan binden können, wenn sie konkatemerisiert werden. Dies wird durch den Befund gestützt, dass artifizielle Konkatemere eine Zunahme des zellprotektiven Effektes mit der Anzahl der repeats im Molekül zeigen, wenn diese rekombinanten Proteine zusammen mit dem Virus zur HeLa Zellkultur zugegeben werden. Dieser Befund könnte bedeuten, dass die antivirale Wirkung auf eine Stabilisierung des Virus zurückzuführen ist indem die Freisetzung der genomischen RNA verhindert wird. Unsere Befunde führen auch zu der Frage ob die Interaktion des Virus mit den natürlich vorkommenden Membranproteinen, wie dem low-density Lipoprotein Rezeptor (LDLR) und dem LDLR-related Protein (LRP), über die Bindung mehrer Module innerhalb eines einzelnen Rezeptormoleküls erfolgt. Die Geometrie der Bindung solcher Moleküle soll mittels Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) Methoden untersucht werden. N-Terminus und C-Terminus artifizieller Konkatemere oder natürlicher Rezeptorfragmente werden dazu mit einem geeigneten FRET Paar markiert. Das Auftreten von FRET in der Gegenwart von Virus zeigt, dass C- und N-Termini innerhalb der Förster Distanz zu liegen kommen. Diese Studien werden durch Affinitätsmessungen an verschiedenen künstliche Konkatemeren und löslichen Fragmenten der natürlichen Rezeptoren mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektrometrie ergänzt. Die minimale, zur Viruserkennung erforderliche Struktur wird identifiziert und der Einfluss von Linker-Länge und Sequenz auf die Bindungsaffinität bestimmt werden. Es ist zu erwarten, dass durch Anpassung der Linker-Länge sehr effiziente Inhibitoren der Virusinfektion erhalten werden. Diese Studien erschließen die Grundlagen der Virusneutralization und führen zu einem besseren Verständnis der Prinzipien der Protein - Protein Interaktion. Sie könnten auch zu neuen Ansatzpunkten für die Herstellung von Virusinhibitoren führen.