Rhinovirus RNA Freisetzung und Membran-Translokation

Humane Rhinoviren (HRVs) besitzen ein RNA Genom, das von einem Proteinmantel, dem Capsid, welches aus vier Proteinen (VP1-VP4) besteht, umschlossen wird. Das sonst eher harmlose "gemeine Schnupfenvirus" stellt vorwiegend für Patienten mit chronischen Atemwegserkran-kungen ein Risiko dar. Da es bis heute noch keine spezifischen antiviralen Mittel gegen HRV Infektionen gibt, soll die Aufklärung der genauen Abläufe des Infektionsprozesses auf molekularer Ebene helfen, wirksame Inhibitoren gegen HRV Infektionen zu entwickeln. Es ist daher das Ziel dieses Projektes, die molekularen Mechanismen des für die Infektion entscheidenden Schrittes der Freisetzung der viralen RNA aus dem Capsid und deren Transport ins Zytoplasma der Wirtszelle zu untersuchen. Diese RNA Freisetzung ist Voraussetzung für die Virusreplikation im Zytoplasma. Für unsere Studien wollen wir HRV2, einen Serotyp der sogenannten "minor receptor group" der Rhinoviren, verwenden, da wir dessen Eintrittsweg in die Wirtszelle bereits sehr gut charaktersiert haben. Alle Vertreter der "minor receptor group" der HRV binden über Rezeptoren der LDL Rezeptor-Familie an ihre Wirtszellen und werden mittels dieser in frühe Endosomen aufgenommen. Dort erfolgt bei pH 6.0 die Dissoziation des Virus von seinem Rezeptor und HRV2 gelangt dann in späte Endosomen, die einen tieferen pH-Wert ( 5.6) besitzen. Durch diesen sauren pH werden im viralen Capsid Konformationsänderungen ausgelöst: VP4 wird aus dem Capsid ausgestoßen, N-terminale Aminosäurereste von VP1 werden exponiert, und die RNA wird aus dem Capsid ausgeschleust. Unsere bisherigen Daten sprechen für die Bildung einer Pore in der endosomalen Membran, durch welche die virale RNA ins Zytoplasma der Wirtszelle gelangt. Wir nehmen an, dass hydrophobe Domänen der Capsidproteine mit der endosomalen Membran interagieren könnten und eine Art Pore bilden, durch welche die virale RNA transportiert wird. Es gibt derzeit keine Daten, welche zellulären Faktoren und "Triebkräfte" für die virale Genomtranslokation über die Endosomenmembran erforderlich sind. HRV2 soll daher als Repräsentant für ein Virus dienen, das sein Genom in den Endosomen freisetzt und mittels einer Pore ins Zytoplasma schleust. Um diesen molekularen Mechanismus aufzuklären, sollen im beantragten Projekt folgende Fragestellungen untersucht werden: 1/ In vivo Anforderungen für den RNA Transport ins Zytoplasma: Es soll der Einfluß des endosomalen pH- Gradienten und des Membranpotentials auf die RNA-Freisetzung und Infektion untersucht werden. Als frühestes Ereignis der Infektion wird die Spaltung von eIFG4 bestimmt. 2/ In vivo Transfer der viralen RNA ins Zytoplasma der Wirtszelle und das weitere Schicksal der RNA. Freigesetzte RNA soll mittels "fluorescent in situ hybridization" detektiert werden; der intrazelluläre Weg der RNA von der Freisetzung in Endosomen bis zum Ort der Replikation soll mittels Colokalisation mit Kompartiment-spezifischen Antikörpern untersucht werden. 4/ In vitro RNA Translokation: Anforderungen und Interaktion von viralen Proteinen mit der Endosomenmembran. Endosomen, welche natives HRV2 enthalten, sollen isoliert werden und einem sauren pH ausgesetzt werden. Dadurch soll eine Konformationsänderung der Capsidproteine und Translokation der RNA in vitro induziert werden. Die RNA, welche ins Inkubationsmedium transportiert wird, soll mittels quantitativer PCR nachgewiesen werden. Die Triebkräfte für diese Translokation sollen ermittelt werden, und die Interaktion von viralen Proteinen mit der viralen RNA und der endosomalen Membran sollen nach einem "crosslinking" analysiert werden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sollen zeigen, welche zellulären Faktoren die RNA Freisetzung ins Zytoplasma beeinflussen, welche viralen Proteine mit der Endosomenmembran interagieren, und wie die RNA über die Endosomenmembran in das Zytoplasma gelangt und zum Ort der Replikation transportiert wird. Diese Kenntnisse sind die Grundlage für das "Design" von Peptiden oder Substanzen, welche den viralen RNA Transport ins Zytoplasma und somit die Infektion blockieren.

Human rhinoviruses (HRVs) are non-enveloped viruses with a RNA genome packaged into a capsid composed of viral proteins VP1-VP4. HRVs are the main cause of the usually harmless common cold - infections that are not life threatening, but may pose a threat for patients with chronic respiratory diseases. Today, there are still no effective and specific treatments against HRV infections available. Thus, exact knowledge of the molecular mechanism of the infection cycle is required to develop specific inhibitors of HRV infections. Therefore, this project focuses on the most important step in viral infections: uncoating and penetration of the viral genome, which is the prerequisite for viral replication in the cytoplasm. For these studies we have chosen the minor group human rhinovirus serotype 2 (HRV2) since it requires endocytosis and low endosomal pH to uncoat its RNA and to infect cells. HRV2 binds to and is internalized by members of the LDL receptor family into early endosomes where mildly acidic pH induces virus-receptor dissociation. Solely due to pH < 5.6 in late endosomes native viruses undergo a conformational change to C-antigenic particles: VP4 is expelled, the N-terminus of VP1 is externalized and the viral RNA is released. Our previous data are in accordance with RNA penetration into the cytoplasm through a pore in the endosomal membrane that involves hydrophobic domains of VP1. Presumably, also VP4 is involved in RNA translocation. So far, the cellular requirements for transfer of a viral genome across intact endosomes in vitro have not been analyzed for any non-enveloped virus. Thus, HRV2 is used as a representative for low pH induced endosomal uncoating and RNA penetration into the cytoplasm by pore formation. To gain insight into the molecular mechanism and driving forces of this process the aims of this proposal are as follows: 1. Requirements and driving forces for RNA translocation in vivo: The role of the endosomal pH gradient and membrane potential for productive uncoating will be investigated by determining cleavage of eIFG4, the earliest event in productive infection. 2. In vivo RNA transfer into the cytoplasm and intracellular fate of the viral RNA: We will apply fluorescent in situ hybridization (FISH) to detect uncoated RNA; its transport from the site of uncoating to the site of replication will be characterized by immuno co-localization with compartment specific markers. 3. In vitro RNA translocation: requirements and interaction of viral components with endosomal membranes: Endosomes containing native HRV2 will be isolated and acidified in vitro to induce the conformational change and RNA translocation. The amount of C-antigen will be correlated with RNA transfer from the endosome interior into the medium as determined by quantitative real-time PCR. The role of a pH gradient, membrane potential, endosomal and cytosolic proteins and ribosomes will be investigated. Viral proteins interacting with the viral RNA during translocation through the endosomal membrane will be cross-linked and analyzed. The results of the proposed experiments should reveal the mechanism and cellular requirements for RNA translocation into the cytosol, the identities of viral and cellular proteins that interact during this process and the route of the viral RNA after translocation to the site of replication. This knowledge then enables the design of short peptides or drugs that block RNA translocation and thus infection.