Telomere Rekombination in immortalen menschlichen Zellen

Jede Zellteilung ist assoziiert mit dem Verlust von telomerer DNA. Bei immortalisierten Zellen, wie beispielsweise bei Tumorzellen, existieren jedoch Mechanismen, die einem telomeren DNA Verlust entgegenwirken. Bis dato sind zwei solcher Mechanismen bekannt. Es ist dies zum einen Telomerase, ein Enzym welches in der Lage ist nach jeder Zellteilung den Verlust von telomerer DNA durch Neusynthese zu kompensieren. Daneben existiert jedoch in vivo wie auch in vitro ein Telomerase unabhängiger Weg der Telomerlängenkontrolle, genannt der ALT Weg. ALT Zellen, obgleich immortal, sind gekennzeichnet durch das völlige Fehlen von Telomerase Aktivität. Weiters zeigen solche Zellen eine charakteristische, äusserst heterogene Verteilung der Telomer Länge mit Chromosomen welche zum einen lange Telomere und zum anderen extrem kurze Telomere haben. Es ist bis dato unbekannt, welche Mechansismen den ATL Weg in Tumorzellen aktivieren. Bekannt ist jedoch, dass homologe DNA Rekombination dafür verantwortlich ist die Telomerlänge in ALT Zellen konstant zu halten. Gegenstand meines Forschungsprojektes ist die zentrale Frage, ob in ALT Zellen verschiedene Mechanismen der homologen DANN Rekombination, nämlich inter-telomere und intra-telomere Rekombination, existieren. Weiters erörtere ich die Frage, ob diese verschiedenen Arten von homologer Rekombination eine unterschiedliche Aufgabe in ALT Zellen erfüllen. Zu diesem Zweck werde ich ein experimentelles Zellmodell etablieren, welches erlauben soll diese beiden unterschiedlichen Typen von homologer Rekombination voneinander zu unterscheiden. Resultate aus diesen Experimenten sind die Grundlage dafür Proteine zu identifizieren, welche die unterschiedlichen Rekombinationsmechanismen aktivieren und erhalten. Nur so ist es in weiterer Folge möglich neue diagnostische Methoden wie auch neue therapeutische Konzepte für ALT Tumore zu entwickeln. Der Umstand, dass wenig über den ALT Weg bekannt ist, beeinträchtigt die Diagnose von ALT Malignomen entscheidend. Störung der Telomer Homeostase ist ein neuartiges und äusserst erfolgsversprechendes Therapiekonzept. Während Hemmung von Telomeraseaktivität unter experimentellen Bedingungen sich bereits als therapeutisches Prinzip unter Beweis gestellt hat, ist derzeit noch keine therapeutische Beeinflussung von telomerer Rekombination in Aussicht. Es ist deshalb mehr Grundlagenforschung notwendig, um die Mechanismen der telomeren Rekombination in ALT Zellen aufzuklären.

Wir haben mit diesem Projekt ein sensitives Nachweissystem für homologe Rekombination am äußeren Ende von Chromosomen (Telomeren) entwickelt. Das Reportersystem verwendet einen Antibiotika Resistenzmarker welcher eine genaue Quantifizierung von Rekombinationsereignissen am telomeren Ende erlaubt. Telomere sind am Ende von Chromosomen lokalisiert und sind aus einer repetitiven Abfolge von Nukleinsäuren zusammengesetzt. Zusammen mit einer Reihe von verschiedenen Proteinen bilden die Telomere eine Schutzkappe für das Chromosom. Diese Schutzkappe erfüllt eine Reihe wichtiger biologischer Funktionen, die wichtigste ist wohl die Aufrechterhaltung der chromosomalen Stabilität durch das Verhindern von End-zu-End Fusionen. Mit jeder Zellteilung, verlieren Telomere ein kleines Stück ihrer DNA. Dieser Verlust an telomerer DNA führt schlussendlich dazu, daß die Schutzkappen Funktion nicht mehr aufrecht erhalten werden kann. Die Folge davon ist eine zelluläre Krise bei der genetische Instabilität und Zelltod eintreten. Unlimitiertes Zellwachstum ist unweigerlich an die Funktionsfähigkeit der telomeren Schutzkappen gebunden. Krebszellen, die sich ja unlimitiert teilen können, haben aus diesem Grund einen Mechanismus entwickelt, der dem zellteilungsbedingten Telomerverlust entgegen wirkt. Die homologe Rekombination von telomerer DNA (genannt ALT Weg) ist ein solcher Mechanismus. Der andere Mechanismus ist durch das Enzym Telomerase gegeben. In Krebszellen ist entweder der ALT Weg oder der Telomerase Weg aktiv. Die Mechanismen die zur Aktivierung des ALT Weges führen sind unerforscht. Mit unserem Reporter System haben wir zahlreiche Zellklone etabliert, welche das Reporter System an der Basis des Telomeres platziert haben und wo die homologe DNA Rekombination über eine kurze Strecke telomerer Sequenz laufen muss. Wir fanden, daß das Reporter System in seiner Position in manchen Klonen stabil bleibt, und in diesen Klonen das Reporter System nicht Teil der telomeren Schutzkappe ist. Um dies zu diagnostizieren haben wir einen neuartigen Test entwickelt. Wie unsere Experimente zeigen, sind homologe DNA Rekombinationsereignisse mit einer sehr niedrigen Häufigkeit in ALT Zellen wie auch in Telomerase positiven Zellen vorhanden. Bisherige Erkenntnisse gingen davon aus, daß Telomerase positive Zellen keine telomere Rekombination durchmachen. Zusammen mit früheren Daten, lassen unsere Ergebnisse mutmaßen, daß die telomere Rekombination an der Basis der Telomere andersartig ist verglichen mit der Rekombination im übrigen Telomer. In unserem Arbeitsmodell stellen wir die Hypothese auf, daß die unterbrochene DNA Replikation zu diesen Rekombinationsereignissen führt.