Autoregulation in Nervenzellen über Nukleotidrezeptoren

In nicht-neuronalen Geweben, wie Leber, Niere, Knochen oder Blutgefäße, dienen Nukleotide der autokrinen/parakrinen Regulation. Diese hängt nicht nur von den involvierten Rezeptoren ab, sondern auch von der enzymatischen Aktivität der Ektonukleotidasen. Rückkopplungshemmung der Neurotransmitterfreisetzung durch Nukleotide wurde schon beschrieben, die involvierten Rezeptoren und Signaltransduktionsmechanismen blieben aber weitghend unbekannt. Ein Teil dieses Projekts wird die P2Y Rezeptor Subtype(n) und Signaltransduktionsmechanismen in der Autoinhibition der Transmitterfreisetzung aus PC12 Zellen und sympathischen Neuronen identifizieren. Die vorläufigen Daten zeigen, dass eine Hemmung spannungsaktivierter Ca2+ Kanäle über P2Y 12 und/oder 13 Rezeptoren und G Protein beta/gamma Untereinheiten involviert sind. Zukünftige Experimente werden diesen Signalweg im Detail aufklären. Weitere initiale Ergebnisse zeigen auch, dass ein zweiter, noch unbekannter Signalweg eingebunden ist, und dieser wird auch charakterisiert werden. In vorangegangenen Arbeiten (unterstützt durch das FWF Projekt P14951) konnten wir nachweisen, dass endogene Nukleotide an P2Y Rezeptoren in PC12 Zellen aktivitätsabhängig angreifen: Die Aktivierung Triphosphat- sensitiver Rezeptoren benötigt Depolarisation, während die Aktivierung Diphosphat-sensitiver Rezeptoren spontan abläuft. Da PC12 Zellen 7 mal mehr ATP als ADP speichern und freisetzen, müssen an letzterem Effekt Nukleotidasen beteiligt sein. Im vorliegenden Projekt wird untersucht, wie Vesikelexozytose, Ektonukleotidasen und P2Y Rezeptoren kooperieren, um diese aktivitätsabhängige Autoregulation zu ermöglichen. Die Experimente sind darauf ausgerichtet zu klären, (i) ob Nukleotide aus PC12 Zellen nur durch Exozytose oder auch durch andere Mechanismen (wie in nicht-neuronalen Zellen) freigesetzt werden, (ii) ob Ektonukleotidasen und P2Y Rezeptoren eng benachbart liegen müssen, um die Versorgung mit den richtigen Nukleotiden zu garantieren, und (iii) ob Ektonukleotidasen und P2Y Rezeptoren in direkten Kontakt miteinander treten und eventuell Subtyp-abhängig miteinander interagieren. In Nervenzellen reguliert die Modulation von N-Typ Ca2+ und M-Typ K+ Kanälen über G Protein-gekoppelte Rezeptoren die Zellfunktion. Diese Ionenkanäle werden auch über native und rekombinante P2Y Rezeptoren moduliert. Unsere vorläufigen Daten zeigen, dass auch eine andere Klasse von Ionenkanälen, nämlich Ca2+-abhängige K+ Kanäle, über P2Y Rezeptoren reguliert werden. Welche P2Y Rezeptoren und angeschlossene Signalkaskaden diese Ionenkanäle beeinflussen können, wird auch in diesem Projekt geklärt werden. Insgesamt werden die Ergebnisse dieses Projekts das Netzwerk beleuchten, durch welches Nukleotide zur neuronalen Autoregulation beitragen.

In nicht-neuronalen Geweben, wie Leber, Niere, Knochen oder Blutgefäßen, waren Nukleotide schon lange als autokrine/parakrine Faktoren bekannt, deren Funktion nicht nur von den involvierten Rezeptoren abhängt, sondern auch von der enzymatischen Aktivität der Ektonukleotidasen. In diesem Projekt wurde die Autoregulation durch Nukleotide in Nervenzellen untersucht. Dabei wurde geklärt, wie Vesikelexozytose, Nukleotidrezeptoren und Nukleotidasen kooperieren, um verschiedene neuronale Effektorsysteme zu kontrollieren. Durch den Einsatz von Botulinum Toxin C1 gelang der Nachweis, dass die spontane Nukleotidfreisetzung aus neuroendokrinen Zellen keiner Exozytose bedarf, sondern auf ähnlichen Mechanismen wie in nicht-neuronalen Zellen beruht. Im Gegensatz dazu wurde die depolarisationsbedingte Freisetzung der Nukleotide durch dieses Neurotoxin völlig unterdrückt. Es zeigte sich außerdem, dass Nukleotide Transmitterfreisetzung aus sympathischen Nervenzellen und der neuroendokrinen Zelllinie PC12 über P2Y 12 Rezeptoren einschränken, wobei dies durch die Hemmung von CaV 2 Ca2+ Kanälen über G Protein beta/gamma Untereinheiten vermittelt wird. Daneben wurde beschrieben, dass die sympathische Transmitterfreisetzung auch durch präsynaptische P2Y 1 Rezeptoren reguliert wird, indem deren Aktivierung zu einer Steigerung der Freisetzung führt. Zuvor war noch nie ein stimulierender präsynaptische P2Y Rezeptor gefunden worden. Angesichts des Befundes, dass zwei verschiedene P2Y Rezeptoren in sympathischen Axonendigungen zur Autoregulation der Transmitterfreisetzung beitragen, wurde mittels FRET (Fluoreszenz-Resonanz-Energie- Transfer) Mikroskopie untersucht, ob P2Y 1 , P2Y 2 , P2Y 12, und P2Y 13, sowie Adenosin Rezeptoren miteinander interagieren können. Es zeigte sich, dass all diese Rezeptoren miteinander paarweise heteromere Komplexe bilden können, und außerdem direkt mit dem ATP abbauenden Enzym NTPDase 1 (aber nicht mit NTPDase 2) interagieren. In elektrophysiologischen Experimenten wurden auch neue Effektorproteine für neuronale P2Y Rezeptoren identifiziert: Über heterolog exprimierte P2Y 1 Rezeptoren verursachte ADP in PC12 Zellen einen Phospholipase C- vermittelten Anstieg der intrazellulären Ca2+ Konzentration und dadurch eine Aktivierung Ca2+-abhängiger K+ Kanäle. Daher gehören diese Kanäle neben CaV 2, Kir 3, und KV 7 zur Gruppe jener Kanäle, die durch neuronale Nukleotidrezeptoren kontrolliert werden. Zusammengefasst beschreiben die Resultate dieses Projekts ein Signalnetzwerk aus Vesikeln, Rezeptoren, Enzymen und Ionenkanälen, über welches Nukleotide neuronale Autoregulation gewährleisten.