Neues Cytokin als Regulator von EMT und Metastasierung

Metastasierung von Epithelzelltumoren (Karzinome) stellt die Todesursache bei > 80 der Krebspatienten dar. Viele Aspekte der Karzinogenese sind mechanistisch gut erforscht, weniger ist jedoch über Mechanismen bekannt, welche die lokale Invasion und Metastasierung von Karzinomzellen steuern. Als Modellsystem verwenden wir polarisierte Brustepithelzellen der Maus (EpH4), die in Kollagen-Gelen organotypische Hohlstrukturen ausbilden. An diesem in vitro/in vivo Zellmodell entdeckten wir, dass epithelial/ mesenchymale Transition (EMT, i.e. Transdifferenzierung epithelialer Zellen zu solchen mit mesenchymalen Eigenschaften) ein zentraler Prozess bei der lokalen Invasion und Metastasierung ist. In EpH4 Zellen werden EMT und Metastasenbildung durch die Kooperation von Rezeptoren des transforming growh factor (TGF) beta mit onkogenem Ras (EpRas-Zellen), induziert, welches über die Signalüberträger ERK/ MAPK und PI3K wirkt. Durch globale Expressionsprofilierung von polysomengebundener mRNA konnten wir bereits Kandiaten-Gene und Signalwege identfizieren, welche eine wichtige Rolle bei der Regulation der epithelialen Plastizität und Metastasenbildung spielen. In diesem Projekt soll das Genprodukt eines dieser EMT/Metastasen-spezifischen Gene (FAM3C/ILEI) näher untersucht werden. ILEI ist ein neuartiges, strukturell mit Cytokinen verwandtes, sezerniertes Protein. Erste Ergebnisse legen nahe, dass ILEI für EMT und Metastasierung essentiell ist und weitgehend allein, z.B. in Kooperation mit antiapoptotischen Genen EMT, Tumoren und Metastasen erzeugt. In ILEI-exprimierenden EpH4- oder EpRas-Abkömmlinge soll die Funktion von ILEI bei EMT, Tumorwachstum und Metastasenbildung untersucht werden, vor allem in 3D Kollagen-Gelen und immundefizienten Mäusen. Hierzu werden EpH4/EpRas- Derivate eingesetzt, die keine Tumoren bilden (z.B. apoptose-geschützte EpH4 Zellen) oder nicht metastatisch sind. Zweitens soll das in metastatischen Zellen (EpRas-XT) überexprimierte, endogene ILEI durch stabile RNA- Inaktivierung (knockdown durch RNAi) ausgeschaltet werden, um damit möglicherweise EMT und Metastasen- bildung zu unterdrücken. In Experimenten zum molekularen Mechanismus der ILEI-Wirkung wird getestet (i) ob gereinigtes, rekombinantes ILEI die Effekte von überexprimiertem ILEI in Zellen ersetzen kann, (ii) ob neutralierende Antikörper gegen ILEI EMT und Metastasenbildung hemmen, (iii) welche Signaltransduktionswege durch überexprimiertes oder extrazelluläres, rekombinantes ILEI beeinflusst werden und (iv) ob diese Signalwege für die ILEI-induzierten Phänotypen wichtig sind. Mit Boehringer Ingelheim (BI) und universitären Partnern werden wir die Expression von ILEI in menschlichen Tumoren und Normalgeweben untersuchen und Mausmodelle für die in vivo Funktion von ILEI entwickeln. Das gemeinsame Langzeit-Ziel dieses Projektes mit BI ist es, die Eignung von ILEI als "target" für funktionsblockierende, monoklonale Antikörper zur Behandlung von metastasierenden, menschlichen Tumoren zu untersuchen.

Der Befall weit vom Tumor entfernter Organe durch bösartige Tumorzellen (Metastasierung) führt zum Tod von > 90% aller unter epithelialen Tumoren (Karzinomen) leidenden Patienten. Während der Progression von Karzinomen zu metastasierenden Tumoren verlieren die befallenen Epithelien ihre typische geordnete und polare Struktur (epitheliale Polarität). Im vorliegenden Projekt fanden und characterisierten wir drei wichtige Proteine, die EMT, d.h. einen Verlust dieser epithelialen Organisation bewirken und damit Metastasierung auslösen können. Das erste dieser Proteine ist ILEI (interleukin-like EMT inducer), ein kleines sezerniertes 24kd Protein mit doppelter Funktion. Unreifes, intrazelluläres ILEI bewirkt EMT in Zusammenarbeit mit einem Onkoprotein (Ras), während sekretiertes "reifes" ILEI eine Funktion bei der Erzeugung einer chronisch entzündlichen Tumorumgebung durch das Tumor-Stroma haben könnte. In mehreren Ras-exprimierenden, epithelialen Zellmodellen war die Überexpression von ILEI notwendig und hinreichend, um EMT in Zellkultur und Metastasierung in Mäusen zu bewirken. Dies galt auch für ein Zellmodell, bei dem die Zellen nach (orthotopischer) Induktion von Mammatumoren in vivo zur Lunge metastasieren. In Normalgewebe und benignen Tumoren war ILEI nur in einem speziellen, für epitheliale Polarität zentralen Organell lokalisiert. In Zellen nach EMT und metastasierenden Tumoren war ILEI dagegen komplett ins gesamte Cytoplasma delokalisiert. Diese abnormale ILEI-Lokalisation erlaubte es, eine stark erhöhte Meta-stasierung und Mortalität in über 70 Brustkrebspatienten zu prognostizieren. Um diese Idee einer sehr komplexen Wirkungsweise von ILEI abzusichern, untersuchten wir zwei andere Proteine, welche den Verlust epithelialer Organisation (EMT) bewirken können, nämlich CREG (cellular repressor of E1A- regulated genes) and Annexin A1 (AnxA1). Beide Proteine funktionieren intrazellulär, und nach Sekretion durch Bindung an Rezeptoren. In Zellen von genetisch veränderten AnxA1-negativen Mäusen ist die Inaktivierung eines solchen Rezeptors durch Transport in Protein-abbauende Organelle (Lysosomen) defekt. CREG wird einerseits durch Rezeptorbindung ins Lysosom geschleust, reguliert als intrazelluläres Protein aber auch Gene für Zellwachstum. Überexpression von CREG und experimentell erzeugter Expressionsverlust von AnxA1 durch RNA- Interferenz (RNAi) induziert EMT und Metastasierung in mehreren Zellmodellen, was durch CREG-RNAi und AnxA1-Reexpression verhindert werden konnte. Wenn wir AnxA1 in menschlichen, AnxA1-negativen, EMT- zeigenden und metastatischen Brustkarzinomzellen re-exprimerten, wurden diese in epitheliale, nicht mehr metastasierende Zellen umgewandelt. In Zellen nach AnxA1 knockdown (RNAi) war ein Signalüberträger-Protein mit vermuteter onkogener Funktion - signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) - essentiell für die durch AnxA1-knockdown erzeugte EMT. Die zukünftige Arbeit wird sich auf Mechanismen konzentrieren, durch welche ILEI, CREG und AnxA1 die Funktion "molekularer Maschinen" hemmen oder ändern, welche die epitheliale Polarität induzieren und aufrechterhalten, Dabei werden wir ein Protein eines solchen Proteinkomplexes, nämlich Scribble, als positive Kontrolle verwenden, Verlust von Scribble plus Ras supprimiert die Invasivität von Tumorzellen in Drosophila und erzeugt EMT in Säugerzellen. Hierzu haben wir ein Zellmodell, welches den "gold standard" zur molekularen Charakterisierung solcher "Polarity protein machines" darstellt, so genetisch verändert, dass wir durch extrazelluläre Liganden EMT in diesen Zellen indu-zieren können. Im MDCK-Modell existieren mehr molekulare "Werkzeuge" als in irgendeinem anderen Modell. Wir werden diesen Ansatz durch in vivo-Experimente in genetisch veränderten Mäusen ergänzen, welche vor kurzem von unseren Kooperationspartner hergestellt wurden und denen entweder ILEI fehlt (ILEI-/-) oder welche ein ILEI -Transgen unter der Kontrolle eines Drogen (Tetrazyklin)-induzierbaren Transkriptionsfaktors (Tet-Operator) exprimieren. Wir erwarten, dass durch unsere Arbeiten eine Reihe neuer "targets" für Krebsmedikamente, d.h. niedermolekulare Chemikalien oder therapeutische, monoklonale Antikörper, erzeugt werden können, in Zusammenarbeit mit unserem Partner in der Pharmaindustrie (Boehringer Ingelheim (BI) Vienna, und BI-Germany).