Ca2+ Kanal Signal-Komplexe in Hippocampusneuronen

Spannungs-aktivierte Kalziumkanäle spielen eine wichtige Rolle in vielen Funktionen des zentralen Nervensystems. Sie steuern die Freisetzung von Überträgersubstanzen, regulieren die Gen-Expression und sind an synaptischen Prozessen von Lernen und Gedächtnis beteiligt. Die Spezifität der Kalziumsignale in all diesen Aufgaben wird erreicht, indem verschiedene Kanaltypen räumlich getrennt in unterschiedlichen makromolekularen Signalkomplexen vorkommen. Somit müssen molekulare Mechanismen für den funktionellen Einbau von Kalziumkanälen in spezifische neuronale Signalkomplexe existieren. Ziel dieses Forschungsvorhabens ist es, solche Targeting-Mechanismen zu entschlüsseln und jene molekularen Wechselwirkungen von Kalziumkanälen mit s.g. Scaffold-Proteinen darzustellen, die den gerichteten Einbau der Kanäle in die jeweiligen Signalkomplexe bewerkstelligen. Im vorangehenden Projekt entwickelten wir ein neuronales Expressionssystem, molekulare Werkzeuge und Analysetechniken, die eine Beschreibung der subzellulären Verteilung von L-Typ Kalziumkanälen (CaV1.2/ a 1C ) mit hoher Präzision ermöglichen. Hier bauen wir auf diese Expertise auf, indem wir molekulare Wechselwirkungen von Kalziumkanälen mit bekannten Interaktionspartnern experimentell hindern und die Auswirkungen auf die Lokalisation und Funktion der Kanäle in kultivierten Hippocampusneuronen untersuchen. Die zu untersuchenden Kanalpartner sind die Kalziumkanal beta- Untereinheit, AKAP79 und das PDZ Protein NIL-16. Die Protein-Protein Wechselwirkungen werden inhibiert durch Deletion oder Mutation der Interaktionssequenzen im Kanal, durch Überexpression von kompetitierenden Peptiden und Proteinen, und durch Depletion der Bindungspartner mittels der neuen siRNA Technik. Weiters werden Expression und Einbau in synaptische Nervenendigungen von Kanalmutanten (CaV2.1/a 1A-FHM1) untersucht, die familiäre hemiplege Migräne verursachen. Auswirkungen all dieser experimentellen Eingriffe auf die Organisation von Kalziumkanälen in spezifischen neuronalen Kompartimenten werden mittels hoch- auflösender Immunfluoreszenz-Mikroskopie untersucht. Die Entschlüsselung jener Mechanismen, die der funktionellen Organisation von Kalziumkanälen in neuronalen Signaltransduktions-Komplexen zu Grunde liegen, ist von großer Bedeutung für die molekularen und zellulären Neurowissenschaften und besitzt wesentliche klinische Implikationen. Die zu erwartenden Resultate sind wichtig für unser Verständnis der funktionellen Struktur von Ionenkanälen, der Spezifität von Kalziumsignalen in neuronalen Funktionen, der Pathophysiologie Kanal-bedingter Erkrankungen (Channelophathies), sowie für das Auffinden von Modulatoren Kalzium-gesteuerter Prozesse im zentralen Nervensystem.

Spannungs-abhängige Kalziumkanäle steuern wichtige Funktionen von Nervenzellen wie die synaptischen Übertragung und Plastizität. Störungen ihrer Funktion verursachen neuronale Erkrankungen wie z.B. Migräne oder Epilepsie. Ihre Funktion erfüllen die Kalziumkanäle im Kontext von makromolekularen Signalkomplexen in der prä- und postsynaptischen Membran. Wie die Kanäle allerdings in diese "molekularen Maschinen" eingebaut werden und dort mit anderen Proteinen funktionell interagieren ist noch weitgehend unbekannt. Das Ziel dieses Projektes war es daher, jene molekularen Mechanismen zu ergründen, die dem funktionellen Einbau von Kalziumkanälen in prä- und postsynaptischen Signalkomplexen zugrunde liegen. Um die Rolle von spezifischen Protein-Protein Interaktionen zu untersuchen, mutierten wir zunächst jene Sequenzen im Kalziumkanal, die für die Interaktion mit potentiellen Bindungspartnern verantwortlich sind. Die solchermaßen untersuchten Bindungspartner waren AKAP79/150, PDZ-Proteine und die Kalziumkanal ß Untereinheit, denen allen in früheren Arbeiten eine wichtige Funktion im Einbau des Kanals in die Membran bzw. in spezifische Signalkomplexe zugesprochen wurde. Daher war es unerwartet, dass weder die Mutation der Bindungsstelle für AKAP79/150, noch jener für PDZ- Proteine zu einer verringerten Expression oder veränderten Lokalisation des L-Typ Kalziumkanals führte. In gleicher Weise zeigte auch eine pharmakologische Behandlung, die beide Proteine aus dem postsynaptischen Kompartiment entfernte, keinerlei Veränderung der Lokalisation des untersuchten Kanals. Diese Experimente zeigten nicht nur, dass die Lokalisation des Kalziumkanals in der postsynaptischen Membran hippocampaler Neurone nicht von AKAP79/150 oder PDZ-Protein abhängig ist, sondern auch, dass diese Kalziumkanäle in eigenen Signalkomplexen unabhängig von jenen der Neurotransmitterrezeptoren existieren. Im Unterschied zu diesen Experimenten, verhinderte eine Mutation der ß Interaktionstelle vollständig den Membraneinbau des Kalziumkanals. Dies bewies, dass die Bindung der ß Untereinheit an den Kanal essenziell für dessen funktioneller Expression in Neuronen ist. Ob die b Untereinheit allerdings auch am spezifischen Einbau des Kanals in postsynaptische Signalkomplexe beteiligt ist bleibt einstweilen unbeantwortet. Die Expression uns subzelluläre Lokalisation aller vier ß Untereinheiten zeigte, dass alle ß Untereinheiten sowohl an prä- als auch an postsynatische Kalziumkanäle binden können, und somit kaum für den spezifischen Einbau in Signalkomplexe verantwortlich sein können. Überdies zeigten diese Untersuchungen, dass eine Variante der ß Untereinheit - ß 4b - in Zellkernen junger und elektrisch inaktiver Neurone vorkommt. Dieser unerwartete Befund deutet auf eine bisher unbekannte Funktion der ß Untereinheit unabhängig vom Kanalkomplex und wird in einem Folgeprojekt untersucht.