Rolle des Ca2+ Kanals alpha2delta1 in Hippocampusneuronen

Spannungs-aktivierte Kalziumkanäle spielen in vielen Funktionen des zentralen Nervensystems (ZNS) eine wichtige Rolle. Sie steuern die neuronale Entwicklung, die Übertragung elektrischer Signale an den Synapsen, die Verarbeitung dieser Signale sowie die Übertragung von Membrandepolarisationen zu intrazellulären Signalen. Um diese vielfältigen Funktionen zu bewerkstelligen besitzen Neurone eine Vielfalt unterschiedlicher Kalziumkanälen. Diese Kanäle bestehen aus der Poren-bildenden alpha1 Untereinheit und aus alpha2/delta, beta und gamma Untereinheiten. Während "knock-out" Mäuse bereits wesentlich zur Aufklärung der Funktionen aller anderen Untereinheiten beigetragen haben, existiert bis heute kein vergleichbares Tiermodell für die alpha2/delta-1 Untereinheit. Aus diesem Grund ist wenig über die spezifischen Funktionen von alpha2/delta-1 in differenzierten Zellen, wie z.B. Nervenzellen, bekannt. Der Umstand, daß Gabapentin und Pregabalin, zwei wichtige Medikamente zur Behandlung von neuropathischem Schmerz und Epilepsie, an diese Untereinheit binden, macht die Aufklärung der Funktionen von alpha2/delta-1 besonders wichtig. Das Ziel dieses Projektes ist es, die Rolle der Kalziumkanal alpha2/delta-1 Untereinheit in ZNS Neuronen mithilfe von RNA Interferenz zu entschlüsseln. Im vorangegangenen Projekt habe ich sowohl ein neuronales Expressionssystem (kultivierte Hippocampusneurone) als auch die notwendigen Analysetechniken und molekularen Werkzeuge etabliert. Diese Techniken beinhalten auch die RNA Interferenz Technik (siRNA) um, ähnlich wie in knock-out Mäusen, die Expression der alpha2/delta-1 Untereinheit in verschiedenen Zellsystemen zu unterdrücken. Im beantragten Projekt sollen quantitative und einzelzell RT-PCR verwendet werden, um die Effizienz der alpha2/delta-1 Unterdrückung durch siRNA zu demonstrieren, und deren Auswirkungen auf die Kalziumkanalzusammensetzung und die anderen alpha2/delta Untereinheiten und eine mögliche Kompensation durch andere Kanal-isoformen zu erforschen. Die Folgen des alpha2/delta-1 "knock-downs" auf die Differenzierung, die Synaptogenese und das Targeting von prä- und postsynaptischen Kalziumkanälen in kultivierten Hippocampusneuronen werden mittels hoch-auflösender Immunfluoreszenz-Mikroskopie untersucht. Mögliche Auswirkungen auf die synaptische Funktion werden mittels eines fluoreszenz-Tests für die Fusion synaptischer Vesikel analysiert. Die Entschlüsselung der Funktionen der alpha2/delta-1 Kalziumkanaluntereinheit in Neuronen ist einen wichtiger Schritt um die Mechanismen der Kalzium-abhängigen Signalweiterleitung im normalen und erkrankten Nervensystem zu verstehen.

Rolle des Kalziumkanals alpha-2/delta-1 in Hippocampusneuronen: Spannungsabhängige Kalziumkanäle sind für den Einstrom des "second Messengers" Kalzium in erregbare Zellen verantwortlich. In Nervenzellen regulieren Kalziumkanäle wichtige Funktionen, darunter die synaptische Übertragung und Plastizität, und sind daher für das Lernen und die Bildung von Gedächtnis von großer Bedeutung. Verschiedene Erkrankungen, wie zum Beispiel Herzarrhythmien, Migräne oder Epilepsie, können demzufolge durch genetische Defekte von Kalziumkanälen verursacht werden. Kalziumkanäle bestehen aus bis zu vier verschiedenen Proteinuntereinheiten. Die größte Untereinheit wird als Alpha-1 bezeichnet und enthält die Pore und den sogenannten Spannungssensor. Die drei zusätzlichen Untereinheiten heißen Alpha-2/delta, Beta und Gamma. Deren Rolle ist es, den Einstrom von Kalzium in die Zelle durch Alpha-1 zu unterstützen. Die Bedeutung der Alpha-2/delta Untereinheit für die Membranexpression und die biophysikalischen Eigenschaften von Kalziumkanälen ist seit längerem bekannt. Vergleichsweise wenig weiß man über die spezifischen zellulären Funktionen dieser Untereinheit in nativen Zellen des Skelettmuskels, des Herzen, oder des Gehirns. Das vorrangige Ziel dieses Projekts war daher die Rolle der Alpha-2/delta Untereinheit in differenzierten Nervenzellen, speziell in kultivierten Hippocampusneuronen, zu verstehen. Wenn diese Untereinheit tatsächlich an wichtigen Funktionen beteiligt ist, sollte eine Unterdrückung ihrer Expression veränderte zelluläre Funktionen nach sich ziehen, welche wiederum in Experimenten getestet werden können. Zur Beantwortung dieser Frage mußten verschiedene methodische und wissenschaftliche Aspekte bearbeitet werden: Zuerst entwickelten wir die molekularen Hilfsmittel, um die Expression von Alpha-2/delta zu unterdrücken. Diese wurden daraufhin in einem Herzmuskelzellmodell getestet. Durch die Kombination von elektrophysiologischen Messungen und einem mathematischen Modell, welches sämtliche Ionenströme von Herzmuskelzellen berechnet, konnten wir die Bedeutung der Alpha-2/delta Untereinheit für die Ausprägung des kardialen Aktionspotentials und der zellulären Kalziumkonzentration nachweisen und daraus deren absolute Notwendigkeit für eine normale Herzfunktion ableiten. In einem nächsten Schritt zeigte sich, daß sich die Wirkungsweise von Alpha-2/delta auf neuronale Kalziumkanäle deutlich von der im Muskel unterscheidet. Aufgrund dieser Ungleichheit beschrieben wir die Rolle der Alpha-2/delta und Beta Untereinheiten in einem neuen Modell, das in zukünftigen Studien getestet werden kann. Ein Nebenaspekt des Projektes vermittelte uns neue Einblicke in die Bedeutung der Interaktion von Alpha-1 und Beta Untereinheiten für die Kanallokalisation und Membranexpression. Die Verteilung der vier Beta Untereinheiten in kultivierten Hippocampusneuronen zeigte eine große Redundanz dieser Wechselwirkung. Die Bindung der Beta an die Alpha-1 Untereinheit war jedoch für den Membraneinbau des Kalziumkanals wesentlich, da eine Hemmung dieser Interaktion den totalen Verlust der Membranexpression zur Folge hatte. Diese Analysen gewährten zusätzlich neue Erkenntnisse über die Art des Transports von Kanälen in dendritische "Spines", spezifische neuronale Domänen. Dieser Mechanismus kann durchaus auch auf andere postsynaptische Proteine zutreffen. Schließlich entwickelten wir neue Methoden zur Analyse der Lokalisation von synaptischen Proteinen und zur Quantifizierung der Zusammensetzung der Kalziumkanaluntereinheiten in unterschiedlichen Gehirnregionen und einzelnen Nervenzelltypen.