Plectin-Isoformen und Cytoskelett-Dynamik

Als Prototyp Cytolinkerprotein hat Plectin alle Eigenschaften eines multifunktionellen cytoskelet-tären Vernetzungselements. Es besteht aus mehreren Subdomänen, zeigt mannigfaltige Bindungs-aktivitäten, und ist an intrazellulären Stellen lokalisiert, die von strategischer Bedeutung für die mechanische Stabilisierung der Zelle sind. Es vernetzt die drei cytoskelettären Filamentsysteme und stabilisiert Zell-Matrix und Zell-Zell Kontakte. Darüberhinaus mehren sich Hinweise, dass Plectin eine wichtige Rolle bei Signaltransduktionsprozessen als Plattform für das Andocken und den Aufbau von Proteinkomplexen spielt. Plectin wird in Form verschiedener, durch differentiel-les Spleissen erzeugter Isoformen exprimiert, und es zeichnet sich ab, dass zumindest einige dieser Isoformen unterschiedliche spezifische Funktionen haben. Basierend auf Ergebnissen des Vorprojektes und anderer Vorversuche ist geplant, die Rolle bestimmter Isoformen bei dyna-mischen Prozessen des Cytoskeletts zu analysieren. Die zu untersuchenden Isoformen sind wegen ihrer subzellulären Lokalisation (Assoziation mit Mikrotubuli, Mitochondrien od. Adhäsions-komplexen) oder struktureller Besonderheiten (Isoformen ohne Stabdomäne) von grossem Interesse. Das Projekt umfasst folgenden Schwerpunkte: 1) Rolle der Plectin-Isoform 1c bei dynamischen Mikrotubuli-abhängigen Prozessen, einschließlich Organellentransport, 2) Plectin-Isoform 1f als Vermittler von Actin- und Intermediärfilament-Systemen mit zellulären Adhäsions-komplexen, 3) Funktion von Plectin-Isoformen ohne Stab-Domäne, und 4) Identifikation von mitochondrialen Bindungsproteinen von Plectin- Isoform 1b einschliesslich funktioneller Aspekte. Der experimentelle Ansatz stützt sich zu einem Grossteil auf primäre oder immortalisierte, aus Plectin-Null oder Isoform-defizienten Mäusen isolierte Zellkulturen, und deren Vergleich mit normalen (Plectin-enthaltenden) Zellen. Dabei handelt es sich in erster Linie um Keratinocyten, Fibroblasten und Myocyten, sowie primäre Melanocyten und Neuronen aus dem Hippocampus. Ein Großteil der einzusetzenden Methodik, wie Expression von normalen und mutierten Proteinen in Säugetierzellen (für mikroskopische Analysen), oder in Bakterien und dem Baculovirus-System (für biochemische Analysen), ist in unserem Labor bereits gut etabliert. Außerdem beabsichtigen wir, Video-Mikroskopie für Echtzeit-Beobachtung cytoskelettärer Bewegungsabläufe, wie Auf-/Abbau von Filamenten und deren Kontaktaufnahme mit intrazellulären Strukturen, sowie die Bewegung von Organellen (Melanosomen und Mitochondrien) einzusetzen. Das beantragte Forschungsprojekt soll Licht auf spezifische Funktionen und Wirkungsmechanismen einzelner Plectin-Isoformen im Rahmen dynamischer Prozesse des Cytoskeletts werfen und beitragen, damit verbundene Defekte und Abnormitäten in pathologischen Situationen zu erklären.

Als Prototyp eines Cytolinkerproteins besitzt Plectin alle molekularen Eigenschaften eines multifunktionalen Vernetzungs- und Ordnungselements des Cytoskeletts. Es besitzt Multidomänenstruktur und vielseitige Bindungsaktivitäten und ist an subzelluläre Stellen lokalisiert, die von strategischer Wichtigkeit zur Stärkung der Zelle gegenüber mechanischer Belastung sind. Weiters spielt Plectin eine wichtige Rolle als Plattform beim Aufbau von Proteinkomplexen zur Signaltransduktion. Plectin wird in Form von mehreren Isoformen exprimiert, die durch differentielles Splicing gebildet werden. Hauptziel dieses Projekts war es, die spezifischen Funktionen der einzelnen Plectinisoformen bei Organisation und Dynamik des Cytoskeletts sowie ihren Einfluss auf die Cytoarchitektur und die Signalübermittlung zu untersuchen. Unsere Studien basieren weitgehend auf einer Reihe von bereits vorhandenen, von uns generierten konditionellen und Isoform-defizienten Mauslinien und davon abgeleiteten primären Zellkulturen. Wir konnten zeigen, dass 4 Plectin-Isoformen (1f, 1d, 1b und 1) die wichtigsten Ordnungselemente des myofibrillären Cytoskeletts sind und nicht nur die durch Plectin hervorgerufenen Arten von Muskeldystrophie, sondern auch andere gängige Formen dieser Erkrankung entscheidend beeinflussen. Live Imaging Techniken ermöglichten es uns, durch Plectin1f herbeigeführtes Targeting und die Verankerung des Intermediärfilament- Cytoskeletts an Adhäsionskomplexen von Fibroblasten direkt zu beobachten. Dies ist sowohl für die Zellmigration als auch für Stress-induzierte Signalübermittlung bedeutsam. Weiters konnten wir beweisen, dass Plectin 1a die Verankerung von Keratinfilamenten an Hemidesmosome reguliert und so die Blasenbildung der Haut beeinflusst. Mit der Identifizierung von Plectin 1b als erstes nachgewiesenes Vernetzungsprotein zwischen Cytoskelett und Mitochondrien gelang uns ein weiterer großer Wurf. Weitere Untersuchungen ergaben interessante Zusammenhänge zwischen Plectin-kontrollierter Astrocytenarchitektur und Morbus Alexander (einer Funktionsstörung des Gehirns, die viele vor allem jugendliche Todesopfer fordert) und zwischen der Vernetzung von Plectin-Intermediärfilamenten und durch Nitrosylierung/Oxydation hervorgerufenen Schädigungen des Cytoskeletts von vaskulären (Endothel-) Zellen. Weiters konnten wir zeigen, dass Plectinisoformen den Auf- bzw. Abbau des Intermediärfilamentnetzwerks direkt bestimmen und so die Zellteilung beeinflussen, und dass Plectin die mechanischen Eigenschaften lebender Zellen bestimmt. Andere interessante Untersuchungsergebnisse deuten darauf hin, dass Plectin und hier vor allem Isoform 1c die Dynamik von Mikrotubuli und den Organellentransport steuert - eine weitere Fähigkeit dieses vielseitig begabten Proteins. Aus den Projektarbeiten sind 21 Publikationen hervorgegangen - eine solide Basis für weitere Forschungsprojekte, die uns tiefere Einblicke in die molekularen Mechanismen der vielen Funktionen von Plectin geben können und zum besseren Verständnis der Pathogenese der verschiedenen durch Plectininsuffizienz hervorgerufenen Erkrankungen beitragen sollten.