Der kinetisch definierte Hyperraum von Chemokinen

Die Signalfunktion von Chemokinen bei entzündlichen Reaktionen wird durch die Interaktion mit Heparansulfat (HS) maßgeblich beeinflusst, da sie entscheidende Ereignisse, wie Chemokin-Oligomerisierung und Wechselwirkung mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren bestimmt. Trotz zahlreicher Untersuchungen im Gleichgewicht, ist es dennoch nicht gelungen den zu Grunde liegenden Mechanismus aufzuklären, der jenen Zustand des Chemokins hervorbringt, welcher letztendlich ausschlaggebend ist für die weitere Funktion. Daher stellen wir die Hypothese auf, dass die Lösung für dieses Schlüsselereignis in derzeit noch völlig unbekannten "pre-steady state" Prozessen in Form von metastabilen Intermediaten (z.B. Faltungsintermediaten) zu finden ist. Um den begrenzten Möglichkeiten im Gleichgewicht, wo Intermediate auf Grund ihrer instabilen Natur im allgemeinen nicht erfassbar sind, auszuweichen, schlagen wir im Rahmen dieses Projektes eine detaillierte kinetische Aufklärung der multifunktionellen Chemokin-Interaktionen durch die Bestimmung der Ratenkonstanten (ks) auf molekularer Ebene vor. Als wichtigste Wechselwirkungen werden untersucht: i) Chemokinentfal- >Chemokingefal (Faltung), ii) Chemokin+Chemokin (Oligomerisierung), iii) Chemokin+HS (HS-Bindung), iiii) Chemokin+R (Rezeptorbindung). Zur Detektion stehen eine Reihe von biophysikalischen Methoden zur Verfügung, wie z.B. "Stopped-Flow", Fluoreszenzanisotropie und Lichtstreuung. Die intramolekularen bzw. intermolekularen Reaktionen können sich jedoch in vivo durch das gleichzeitige Vorhandensein von partiell ungefalteten Chemokinen (erste Hinweise dafür zeigen sich in unseren thermischen Entfaltungsstudien) und deren Interaktionspartnern in der Zelle oder an der Zelloberfläche überschneiden (z.B. [Chemokin+Chemokin]+HS, [Chemokinentfal- > Chemokingefal]+R, etc.). Das angestrebte Ziel dieses Projekts ist das Erstellen einer umfassenden Matrix von Ratenkonstanten aller Reaktionsbeteiligten, um geschwindigkeits-bestimmende Schritte (bedingt durch kinetische Intermediate) zu identifizieren. Damit werden jene molekularen Zustände mit der längsten Lebenszeit detektiert, welche besser für die therapeutische Behandlung von Entzündungen geeignet sein können als jene im Gleichgewicht. Zur vollständigen biophysikalischen Charakterisierung müssen die Intermediate (Faltungs- intermediate oder HS gebundenen Intermediate) allerdings stabilisiert werden. Dabei werden sie durch cross- linking in eine Art "eingefrorenen" Zustand übergeführt, der sie für die Untersuchung ihrer Faltung im Gleichgewicht greifbar machen soll. Als Methoden werden die Zirkulardichroismus- Spektroskopie und Fluoreszenz-Spektroskopie zum Einsatz kommen. Um abschließend ihre Funktionalität noch hinsichtlich des Vermögens für HS-/ Rezeptorbindung zu überprüfen, sind Fluoreszenztitrationen, isothermale Titrationskalorimetrie und Zellattraktionsversuche in situ geplant.

Das Verständnis der biologischen Funktion von Chemokinen ist immer noch von großer Bedeutung, da diese Klasse von Proteinen (zur Zeit mehr als 40 Vertreter) bei einer Fülle von Krankheiten, wie zum Beispiel bei akuter oder chronischer Entzündung, Krebs, Infektionen, aber auch bei kardiovaskulären und neurodegenerativen Erkrankungen, beteiligt sind. Darüber hinaus sind seit der Entdeckung der Chemokine in den späten 70er Jahren des vorigen Jahrhunderts nur 2 Medikamente, welche tatsächlich Chemokine oder ihre Rezeptoren angreifen, auf den Markt gekommen. Daher war die "Mission" dieses Projektes dahingehend ausgelegt, wenig untersuchte Aspekte von Chemokinen, wie die Kinetik der Interaktion mit ihren natürlichen Liganden, den Rezeptoren und Co- Rezeptoren, zu beleuchten. Die Co-Rezeptoren werden repräsentiert von einer Klasse von komplexen Zuckermolekülen, den sogenannten Glykosaminoglykanen (GAGs), deren Einfluß auf die Pharmakologie der Chemokine bis jetzt unterschätzt wurde. Um diesen Hyperraum der Interaktionskinetik von Chemokinen zu erforschen, haben wir Protokolle für die Immobilisierung von GAGs auf Chips zur Anwendung in der Oberflächen- plasmonenresonanz-Spektroskopie entwickelt, um sowohl Gleichgewichtskonstanten als auch Geschwindigkeitskonstanten der Bindung bzw. Dissoziation von Chemokinen und Chemokin-Mutanten messen zu können. Dabei entdeckten wir, daß sich die untersuchten Proteine in ihrem kinetischen Bindunggsverhalten zu GAGs entscheidend unterscheiden. RANTES, zum Beispiel, weist ein sehr komplexes Verhalten auf während IL8 einen einfacheren kinetischen Weg wählt. Alle kinetischen Interaktionsmuster von Chemokinen mit ihren natürlichen GAG-Liganden weisen zumindest teilweise einen kooperativen Charakter bei Bindung auf. Die Stöchiometrie jedoch bleibt unbekannt, da die Bindungsstellen sowohl am Protein als auch am Liganden bei Interaktion gebildet werden können. Durch "Protein Engineering" konnten wir die Zeit, die das Chemokin am GAG gebunden bleibt, verlängern. Diese Erkenntnis ermöglicht uns die Durchführung von in vivo Lokalisationsstudien, welche für die unmittelbare Zukunft geplant sind. Einige Projektresultate sind bereits veröffentlicht, vieles ist im Begriff zusammengeschrieben zu werden. Alles in allem glauben wir, daß dieses Projekt unserer Forschung einen wichtigen Impuls gegeben hat, in eine Richtung, die in Zukunft genauer untersucht werden muß.