Struktur-Funktions Analyse von DegP

Durch ein fein aufeinander abgestimmtes Zusammenspiel zwischen Proteasen und Chaperonen erfolgt die sogenannte Proteinqualitätskontrolle in der Zelle. Das Hitzeschock-Protein DegP (HtrA) vereinigt die gegensätzlichen Aktivitäten einer Protease und eines Chaperons in sich und ermöglicht so eine schnelle und gezielte Reaktion auf Faltungsprobleme, die z.B. durch externe Streß Situationen ausgelöst werden. Das physiologische Wirkungsspektrum von DegP ist weitreichend: Während die bakteriellen Homologe als Hitzeschock-Proteine und Virulenzfaktoren fungieren, nehmen die eukaryotischen Homologe Schlüsselfunktionen beim Zellwachstum, Zellalterung und der Apoptose ein. Vor kurzem gelang uns die Strukturaufklärung des Chaperon-Zustands von DegP aus E. coli. Da der aktive Protease-Zustand sich nicht aus der bekannten Struktur ableiten läßt, sind weitere Strukturarbeiten mittels Röntgenkristallographie für ein umfassendes Verständnis der Funktionsweise von DegP unerläßlich. Kenntnis der Proteasestruktur würde neue Einblicke liefern, wie DegP zwischen "reparierbaren" und "zu verschrottenden" Proteinsubstraten unterscheidet und wie das Umschalten zwischen den antagonistischen Aktivitäten einer Protease und eines Chaperons erfolgt, bzw. im Falle von DegP durch Temperaturänderungen reguliert wird. Zudem möchten wir die Struktur-Funktionsanalyse von DegP auf eukaryontische und "pathogene" Homologe und auf funktionell verwandte PDZ-Proteasen wie z.B. YaeL, DegQ und Tsp, ausdehnen. Obwohl die jeweiligen Protease Domänen dieser Proteine unterschiedlich aufgebaut sind, so kann doch von einem allgemeinen Regulationsmechanismus ausgegangen werden, in dem die PDZ Domänen eine Schlüsselrolle einnehmen. Ziel dieses Antrags ist es, diesen wichtigen Regulationsmechanismus aufzuklären und ein möglichst umfassendes Bild des DegP Protease-Chaperons zu gewinnen.

Alle lebenden Organismen nutzen die Aktivität bestimmter Proteasen und Chaperone, um den Faltungszustand und die Funktionalität der Zellproteinen permanent zu überwachen. Das Fehlschlagen dieser molekularen "Qualitätskontrolle" kann zur Bildung von toxischen Protein-Aggregaten führen, die im Extremfall Ausgangspunkt verschiedener neurodegenerativen Krankheiten sein können. Das bakterielle Hitzeschock-Protein DegP vereint die Eigenschaften einer Protease und eines Chaperons in sich und stellt von daher ein einzigartiges Modellsystem dar, um die molekularen Mechanismen der Protein Qualitätskontrolle aufzuklären. Um die antagonistische Funktionsweise von DegP - abbauend oder rückfaltend - zu untersuchen, charakterisierten wir DegP Komplexe mit verschiedenen Substraten. Unsere Daten zeigen, daß das DegP Molekül einen hochsymmetrischen Verpackungsapparat bildet, der entfaltete Proteine aus der bakterielle Zellhülle erkennt, diese dann einkapselt und so die Gefahr einer Proteinaggregation vermindert. Hierbei scheint das DegP Hexamer als Substratfilter zu fungieren, während die nach Substratbindung gebildeten größeren 12- und 24-mer Partikel die katalytisch aktive Form von DegP darstellen. Strukturanalyse dieser DegP-Substrat Komplexe zeigte, daß die innere Kavität von DegP antagonistische Eigenschaften besitzt. Während eingekapselte Außenmembranproteine durch DegP vor ungünstigen externen Einflüssen abgeschirmt werden und so rasch ihre native Konformation einnehmen können, werden fehlgefaltete Proteine, die einen irreparablen Schaden aufweisen, höchst effektiv in kleine Peptide zerlegt. Oligomerumwandlung und Protease-Aktivierung nach Substratbindung ist ein neuartiger Regulationsmechanismus, der vermutlich auch die Aktivität der menschlichen DegP Homologe HtrA1 und HtrA2 bestimmt, die bei der Ausbildung/Ausbreitung der Parkinson und Alzheimer Krankheit eine Rolle spielen. Im Gegensatz zu den ATP-abhängigen, cytosolischen Proteasen-Chaperone sind die molekularen "Schredder"- Mechanismen der entsprechenden extra-cytosolischen Komplexe größtenteils unbekannt. Die biochemische Analyse der Protease Funktion von DegP enthüllte einen außergewöhnlichen Mechanismus, wie DegP ungefaltete Protein prozessiv in Peptide definierter Länge zerkleinert und dazu einen "molecular ruler" bestehend aus PDZ und Protease Domäne verwendet. Zudem gewährleistet die allosterische Aktivierung durch Peptide, die nicht-stabile Proteinbereiche kennzeichnen, eine rasche und streng regulierte Beseitigung von fehlgefalteten und unstabilen Proteinen. Diese Ergebnisse zeigen, daß die feinabgestimmte Regulation der cytosolischen und extra-cytosolischen Protease Maschinen durch völlig unterschiedliche molekulare Prinzipien erreicht wird.