Die 3D-Struktur von S-Layer Proteins

Zweidimensional kristallin geordnete S-Schichten (Surface Layers, S-Layers) stellen eine häufig auftretende Oberflächenstruktur von prokaryotischen Zellen dar. Trotz der biologischen Bedeutung für die Funktion prokaryotischer Zellen und der potentiellen Anwendungsmöglichkeiten in der Nanobiotechnologie, gibt es noch sehr wenig Information über die molekulare Struktur von S-Schicht-Proteinen. Der Hauptgrund für den Mangel an 3D-Struktur-Informationen liegt in der inhärenten Eigenschaft von S-Schicht-Proteinen, zweidimensionale Gitter auszubilden, die für kristallographische Untersuchungen ungeeignet sind. Im Rahmen dieses Projektes soll die molekulare Struktur von repräsentativen S-Schicht-Proteinen aufgeklärt werden, was zu einem besseren Verständnis der biologischen Funktion und als Basis für die Anwendung von S-Schicht-Proteinen in der Nanobiotechnologie dienen soll. Um 3D-Kristalle von S-Schicht-Proteinen zu erhalten, die für kristallographische Untersuchungen geeignet sind, werden wir drei Strategien anwenden: Erstens sollen N- und C-terminale Deletionsmutanten von S-Schicht- Proteinen (SbsC, SbsB und SbpA), von denen gezeigt wurde, dass sie keine S-Schichten ausbilden, für Kristallisationsexperimente verwendet werden. Mithilfe dieses Ansatzes konnten bereits Kristalle einer N- terminalen und einer C-terminalen Deletionsmutante des S-Schicht-Proteins SbsC von Geobacillus Stearothermophilus erhalten werden. Die C-terminale Deletionsmutante rSbsC(31-844) ergab Kristalle, die bis zu einer Auflösung von 3 A streuten. Von diesen Kristallen wurde bereits ein nativer und verschiedene Schweratomderivatdatensätze gesammelt (Pavkov et al., 2003). In der zweiten Strategielinie werden Cystein-Punktmutanten verwendet, bei denen die Mutation den Assemblierungsvorgang verhindert, und die daher keine S-Schichten ausbilden können. Punktmutanten, bei denen sich die Mutationen an der Oberfläche des Proteins befinden, könnten für die Herstellung von Schweratomderivaten verwendet werden. Im dritten Ansatz werden Kristallisationsversuche von S-Layer Proteinen unter Konditionen durchgeführt, in denen eine Selbstassemblierung nicht stattfindet. Solche Konditionen sind u.a. für das S-Layer Protein SbpA, von Bacillus Sphaericus CCM 2177 identifiziert worden, das in der Abwesenheit von Calciumionen und bei Anwesenheit von löslichem sekundären Zellwandpolymer (SCWP) keine S-Schichten ausbilden kann. Ferner wird die Cokristallisation von S-Schicht-Proteinen und Liganden versucht werden, die aus isoliertem sekundären Zellwandpolymer oder dessen Derivaten bestehen. Die Bestimmung der Komplexstruktur stellt einen wichtigen Beitrag zur Klärung der Funktionsweise von S-Schicht-Proteinen dar.

Zweidimensional kristallin geordnete S-Schichten (Surface Layers, S-Layers) stellen eine häufig auftretende Oberflächenstruktur von prokaryotischen Zellen dar. Trotz der biologischen Bedeutung für die Funktion prokaryotischer Zellen und der potentiellen Anwendungsmöglichkeiten in der Nanobiotechnologie, gibt es noch sehr wenig Information über die molekulare Struktur von S-Schicht-Proteinen. Der Hauptgrund für den Mangel an 3D-Struktur-Informationen liegt in der inhärenten Eigenschaft von S-Schicht-Proteinen, zweidimensionale Gitter auszubilden, die für kristallographische Untersuchungen ungeeignet sind. Im Rahmen dieses Projektes soll die molekulare Struktur von repräsentativen S-Schicht-Proteinen aufgeklärt werden, was zu einem besseren Verständnis der biologischen Funktion und als Basis für die Anwendung von S-Schicht-Proteinen in der Nanobiotechnologie dienen soll. Um 3D-Kristalle von S-Schicht-Proteinen zu erhalten, die für kristallographische Untersuchungen geeignet sind, werden wir drei Strategien anwenden: Erstens sollen N- und C-terminale Deletionsmutanten von S-Schicht- Proteinen (SbsC, SbsB und SbpA), von denen gezeigt wurde, dass sie keine S-Schichten ausbilden, für Kristallisationsexperimente verwendet werden. Mithilfe dieses Ansatzes konnten bereits Kristalle einer N- terminalen und einer C-terminalen Deletionsmutante des S-Schicht-Proteins SbsC von Geobacillus Stearothermophilus erhalten werden. Die C-terminale Deletionsmutante rSbsC(31-844) ergab Kristalle, die bis zu einer Auflösung von 3 A streuten. Von diesen Kristallen wurde bereits ein nativer und verschiedene Schweratomderivatdatensätze gesammelt (Pavkov et al., 2003). In der zweiten Strategielinie werden Cystein-Punktmutanten verwendet, bei denen die Mutation den Assemblierungsvorgang verhindert, und die daher keine S-Schichten ausbilden können. Punktmutanten, bei denen sich die Mutationen an der Oberfläche des Proteins befinden, könnten für die Herstellung von Schweratomderivaten verwendet werden. Im dritten Ansatz werden Kristallisationsversuche von S-Layer Proteinen unter Konditionen durchgeführt, in denen eine Selbstassemblierung nicht stattfindet. Solche Konditionen sind u.a. für das S-Layer Protein SbpA, von Bacillus Sphaericus CCM 2177 identifiziert worden, das in der Abwesenheit von Calciumionen und bei Anwesenheit von löslichem sekundären Zellwandpolymer (SCWP) keine S-Schichten ausbilden kann. Ferner wird die Cokristallisation von S-Schicht-Proteinen und Liganden versucht werden, die aus isoliertem sekundären Zellwandpolymer oder dessen Derivaten bestehen. Die Bestimmung der Komplexstruktur stellt einen wichtigen Beitrag zur Klärung der Funktionsweise von S-Schicht-Proteinen dar.