Funktionelle Analyse der ARIADNE Genfamilie in Arabidopsis

Die Regulation der Proteinstabilität über Ubiquitin abhängige Proteolyse spielt eine wichtige Rolle bei verschiedenen pflanzlichen Entwicklungsvorgängen, wie z.B. bei der Signalübertragung von Hormonen, im Zellzyklus, während der Embryogenese, Blüten- und Blattentwicklung als auch bei Pflanzen- Pathogeninteraktionen. Die Substratspezifität der posttranslationalen Modifikation mit Ubiquitin wird durch die sogenannten E3 Ubiquitinligasen erreicht, die entweder als monomere oder multimere Komplexe vorkommen. Eine wichtige molekulare Komponente dieser E3 Ubiquitinligasen, ist die Anwesenheit von Proteinen mit einer oder mehreren RING (Really INteresting Gene) -Finger Domänen. In Vorarbeiten haben wir in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana die ARIADNE Genfamilie identifiziert. Diese Genfamilie stellt eine neue Klasse von putativen E3 Ubiquitinligasen mit zwei RING-Finger Domänen und einem "in between RING-Finger" Motif dar (Mladek et al., 2003; www.arabidopsis.org/info/genefamily/ARIADNE.html). Auf Basis von Sequenzvergleichen und einer phylogenetischen Analyse klassifizierten wir die 16 ARIADNE Gene in drei Gruppen, wobei zwei dieser Subklassen pflanzenspezifisch sind. Ziel des Projektes ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen, bei denen die ARIADNE Proteine eine Rolle spielen. Die Redundanz der ARIADNE Genfamilie wird mit genetischen, phänotypischen, zellbiologischen und biochemischen Analysen von "knockout" Mutanten überprüft. Die biochemische Bestimmung der E3 Ubiquitinligase Aktivität und Spezifität wird innerhalb bestehender internationaler Kooperationen durchgeführt. Das beantragte Projekte soll integriert werden in das multinational koordinierte funktionelle Arabidopsis Genomprojekt, dessen Ziel die molekulare Charakterisierung jedes Arabidopsis Gens ist.

Die Aktivität, Stabilität (Lebensdauer) sowie subzelluläre Lokalisation von Proteinen kann über deren posttranslationale Modifizierung, das sind Veränderungen nach der Proteinsynthese, reguliert werden. Abgesehen von Phosphorylierungen, Sulfatierungen, Methylierungen, Acetylierungen oder Glycosylierungen können auch reversible Bindungen mit anderen Proteinen z.B. der Ubiquitin-Familie eingegangen werden. Ubiquitinierungen beeinflussen sowohl die Stabilität und Aktivität der modifizierten Proteine, als auch deren intrazelluläre Verteilung und können darüber hinaus die Interaktion mit anderen Proteinen regulieren. Obwohl seit Anfang der 1980er Jahre an den Grundlagen des Ubiquitin-Systems in Hefen und tierischen Organismen geforscht und 2004 der Nobelpreis für Chemie an Aaron Ciechanover, Avram Hershko und Irwin Rose verliehen wurde, war am Beginn des Projektes nur wenig über die Rolle des Ubiquitin-Systems während der Pflanzenentwicklung bekannt. Im Laufe des Projektes wurde seine zentrale Bedeutung z.B. im Zellzyklus, während der Embryogenese, Organentwicklung, bei der Signalübertragung von Hormonen, als auch bei Pathogeninteraktionen evident. Eine zentrale Frage bei der Ubiquitin-abhängigen posttranslationalen Regulation ist die Festlegung der Spezifität. Es werden nämlich nur bestimmte Proteine zu einem bestimmten Zeitpunkt für die Modifikation ausgewählt. Bekannt ist, daß sogenannte E3 Ubiquitinligasen für diese Auswahl verantwortlich sind. Eine wichtige Komponente dieser E3 Ubiquitinligasen, sind Proteine mit einer oder mehreren RING (Really INteresting Gene)-Domänen. In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana gibt es über 400 Proteine, die solche RING-Domänen besitzen und eine putative E3 Ubiquitinligase-Aktivitäten aufweisen könnten. Das Projekt setzte sich das Ziel, die Funktion(en) der ARIADNE Genfamilie von E3 Ubiquitinligasen zu charakterisieren, die zur einer relative neuen Klasse von RBR-Proteinen gezählt werden (Eisenhaber et al., 2007). Die Mitglieder der RBR-Proteine besitzen zwei RING-Domänen und ein "in between RING-Finger" Motif (Mladek et al., 2003). Wir konnten für einige der ARIADNE Proteine zeigen, daß diese tatsächlich als E3 Ubiquitinligasen aktiv sind. Mit Hilfe von Protein-Interaktionsanalysen konnten mögliche Substrate der ARIADNE E3 Ubiquitinligase-Familie identifiziert und deren Bedeutung bei der Antwort auf abiotische Stressoren wie z.B. UV-B Strahlung gezeigt werden. Die Ergebnisse sind ein gutes Beispiel, daß eine detaillierte molekular-genetische, biochemische und zellbiologische Analyse einer Genfamilie weitreichende Erkenntnisse über deren Funktionsdiversifikation und z.B. im Fall der ARIADNE Genfamilie die Grundlage zur Entwicklung von Pflanzen mit verbesserter Stresstoleranz liefern kann.