Funktionelle Bestätigung von EWS-FLI1 Zielgenen

EWS-FLI1 stellt ein Musterbeispiel für ein Krebs-assoziiertes Fusionsgen dar, welches in der Expression eines chimären onkogenen Transkriptionsfaktors mündet. Im vorangegangenen Projekt P14299-B04 klonierten wir genomische DNA aus dem Chromatin von Ewings Sarkomzellen, welche mit EWS-FLI1 ausgefällt werden konnte. So wurden direkte Zielgene im authentischen zellulären Hintergrund unter Vermeidung von artifiziellen Modellsystemen charakterisiert. Mit dieser hypothesefreien Klonierungsstrategie, welche erstmals auf rein physischen Interaktionen zwischen dem Transkriptionsfaktor und seinen Zielgenen basiert, erhielten wir eine Liste von 100 Genen. Ein Drittel dieser Gene zeigte ein für Ewings Sarkome spezifisches Expressionsmuster und war von RNA Interferenz vermittelter Modulation der EWS-FLI1 Expression betroffen. Bisher wurde erst 1 Gen aus dieser Liste, MK-STYX, als ein von EWS-FLI1 direkt reguliertes Gen bestätigt, in dem die EWS-FLI1 Bindungsstelle genau eingegrenzt wurde, die Regulation in Reportergenassays nachgewiesen werden konnte, und eine gleichmäßige Expression in primären Ewings Sarkomen nachgewiesen werden konnte. Im vorliegenden Projektantrag wollen wir die Rolle der MK-STYX Aktivierung durch EWS-FLI1 für die Biologie von Ewings Sarkomen untersuchen und weitere Kandidatengene aus unserer Liste als direkte EWS-FLI1 Zielgene bestätigen. Die Eingrenzung der individuellen EWS-FLI1 Bindungsstellen in ihrem jeweiligen genomischen Kontext soll zur Definition der Struktur EWS-FLI1 responsiver Promoteren führen und jene Transkriptionsfaktoren identifizieren, die mit EWS-FLI1 in der transkriptionellen Aktivierung und Repression seiner Zielgene kooperieren. Indem wir die individuellen molekularen Signaturen (Affymetrix GeneChipanalyse) der Zielgenexpression mit der von EWS-FLI1 vor und nach Modulation durch Verstärkung einerseits und RNA Interferenz-vermittelter Verringerung andererseits vergleichen, wird es uns schließlich möglich sein, eine Hierarchie der Genexpression, an deren Spitze EWS-FLI1 steht , zu definieren.

Zellvermehrung, unbegrenztes Überleben und Blockade der Differenzierung zeichnen embryonale Tumore aus. Es wird angenommen, dass diese Merkmale die Folge von voneinander unabhängigen genetischen Veränderungen sind, die sich mit fortschreitender Zeit anhäufen. Die Ergebnisse dieses Projektes deckten jedoch ein Beispiel eines Tumorproteins auf, das diese Funktionen über verschiedene Mechanismen in einem Molekül vereinigt. Einer dieser Mechanismen wurde im Detail geklärt und eine neue Art der Tumorsuppression beschrieben, welche den NOTCH Signalübertragungsweg und den zentralen Regulator p53 wesentlich beinhaltet. Die meisten Krebserkrankungen im Kindesalter zeichnen sich durch nur wenige genomische Veränderungen aus. In Leukämien und Sarkomen überwiegen Chromosomenumlagerungen, welche oft als einuzige chromosomale Veränderung nachweisbar sind und zu Genfusionen führen. Wir untersuchten das Ewing Sarkom, das durch das EWS-FLI1 Fusionsgen charakterisiert ist. Das entsprechende Genprodukt gehört einer Familie von Gen- regulatorischen Proteinen an, die an DNA in Sequenz spezifischer Weise binden. EWS-FLI1 wird als die treibende Kraft in der Entstehung und dem Wachstums von Ewing Sarkomen angesehen. Jedoch waren die von ihm regulierten Zielgene, welche die Mediatoren der bösartigen Funktion von EWS-FLI1 sind, weitgehend unbekannt. Wir unterdrückten EWS-FLI1 in 7 Ewing Sarkomzelllinien und verglichen die Signatur von EWS-FLI1 mit dem spezifischen Genexpressionsmuster von 59 primären Ewing Sarkomen relativ zu mesenchymalen Vorläuferzellen, dem vermutlichen Ursprungsgewebe für die Erkrankung. Kinetische Untersuchungen ermöglichten uns, EWS-FLI1 Zielgene auf einer pan-genomischen Ebene zu definieren. Wir fanden, dass sich die Architektur von EWS-FLI1 aktivierten und unterdrückten Genen bezüglich des Musters von Bindungsmotiven für Gen-regulatorische Proteine signifikant unterscheidet, und identifizierten die Anreicherung einer speziellen Kombination von DNA Sequenzmotiven spezifisch in EWS-FLI1 aktivierten Genen. Dieses Muster ist ein starker Hinweis auf eine Kooperation zwischen EWS-FLI1 und E2F in der Aufregulation von Zielgenen. Dieses Ergebnis wurde durch pan- genomische DNA-Bindungsstudien für die beiden Proteine bestätigt. Das Resultat unserer Analyse legt nahe, dass EWS-FLI1 ein Aktivator von Genen ist, und dass seine Gen reprimierende Funktion von indirekten Mechanismen bewerkstelligt wird. Bemerkenswert ist, dass EWS-FLI1 aktivierte Gene hauptsächlich in der Zellproliferation und dem Zellwachstum eine Rolle spielen, während EWS-FLI1 unterdrückte Gene mit Differenzierung und Kommunikation zu tun haben. Unter letzteren identifizierten wir zwei Schlüsselkomponenten des in der Gewebsentwicklung wichtigen NOTCH Signalübertragungsweges. Wir fanden, dass die Aktivierung dieses Mechanismus den Tumorsuppressor p53 stimuliert, was zur Hemmung der Zellteilung durch Aktivierung des Zellzyklusinhibitors p21 führt. Im Ewing Sarkom jedoch unterdrückt EWS-FLI1 die NOTCH-Aktivierung und führt so zur Verminderung der basalen p53 Spiegel und damit zu uneingeschränktem Zellwachstum. Da EWS-FLI1 für eine ganze Klasse von in Krebserkrankungen deregulierten Proteinen repräsentativ ist, sind unser experimenteller Ansatz und unsere Ergebnisse nicht nur für Ewing Sarkome sondern generell für die Krebsforschung hoch relevant.