G-Protein gekoppelte Rezeptoren in der Wirtserkennung

Mykoparasitische Trichoderma-Arten wie T. atroviride werden als Biokontroll-Agens gegen diverse pflanzenpathogene Pilze in der Landwirtschaft eingesetzt. Die mykoparasitische Interaktion ist wirtsspezifisch und beinhaltet Erkennung, Angriff und ein daraus resultierendes Abtöten des Wirtspilzes durch Produktion von spezialisierten Infektionstrukturen, Zellwand-lytischen Enzymen und antifungalen Metaboliten. Untersuchungen der an diesen Prozessen beteiligten Signaltransduktionswege zeigten, dass alpha-Untereinheiten von heterotrimeren G- Proteinen, die für die Signalweiterleitung von in der Membran lokalisierten G-Protein-gekoppleten Rezeptoren zu verschiedenen intrazellulären Zielen verantwortlich sind, in der Wirtserkennung und der Aktivierung der mykoparasitischen Antwort eine maßgebliche Rolle spielen. Tga1 und Tga3, die zu den Untergruppen I und III zugehörigen G alpha-Untereinheiten von T. atroviride, beeinflussen neben der Regulation von generellen Wachstumsprozessen und Sporulation auch direkt Mykoparasitismus-relevante Vorgänge wie zB. die Transkription Chitinase-kodierender Gene, die Produktion von antifungalen Metaboliten und die Entstehung von Infektionstrukturen. Extrazelluläre, vom Wirtspilz stammende Signale wie diffusible Moleküle oder auf der Wirtsoberfläche vorhandene Lektine induzieren in Trichoderma die Bildung von Zellwand-lytischen Enzyme und Infektionsstrukturen, jedoch wurden bis jetzt die an der Erkennung der Wirtssignale beteiligten Rezeptoren noch nicht identifiziert. Basierend auf der maßgeblichen Rolle von G-Proteinen am Mykoparasitismus, ist das Ziel des vorliegenden Projektes die Isolation von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren von T. atroviride und die Aufklärung ihrer Funktionen durch die Herstellung von entsprechenden Gendeletions-Mutanten. Weiters soll die direkte Interaktion der isolierten Rezeptoren mit den G-Protein alpha- und beta-Untereinheiten Tga1, Tga2, Tga3 und Tgb1 von T. atroviride durch Anwendung des Hefe 2-Hybrid-Systems untersucht werden und für jene Rezeptoren die sich als Mykoparasitismus-relevant erweisen soll nach zusätzichen Interaktionspartnern geforscht werden. Da das bisherige Wissen über die an der Wirtserkennung beteiligten Signaltransduktionswege sehr beschränkt ist, würde die Isolation und Charakterisierung der verantwortlichen Rezeptoren und die Identifikation ihrer Interaktionspartner einen wesentlichen Fortschritt auf dem Gebiet der Trichoderma-Biokontrolle darstellen. Basierend auf der Tatsache dass Trichoderma auch eine Interaktion mit der Pflanze eingeht, könnten die im Zuge des Projektes erhaltenen Resultate zur Etablierung von Trichoderma als Modell für reziproke Interaktionen zwischen den drei Beteiligten Trichoderma-Wirtspilz-Pflanze dienen.

Ziel dieses Projektes war die Analyse G-Protein gekoppelter Rezeptoren, sogenannter GPCRs, des mykoparasitischen Pilzes Trichoderma atroviride. Zu diesem Zweck wurde einerseits das Repertoire an für GPCRs kodierenden Genen im Genom von T. atroviride analysiert und andererseits wurden ausgewählte Rezeptoren funktionell charakterisiert. Dabei konnte der Gpr1-Rezeptor als erster GPCR eines mykoparasitischen Pilzes als essentiell für die Erkennung von Schadpilzen und für die Steuerung Mykoparasitismus-relevanter Prozesse identifiziert werden. Nützliche Pilze des Genus Trichoderma werden als Biokontroll-Agentien zum Schutz von Pflanzen gegen diverse krankmachende Pilze in der Landwirtschaft eingesetzt und stellen somit eine vielversprechende Alternative zu chemischen Fungiziden dar. Neben ihrer Fähigkeit in nutzbringender Weise direkt mit der Pflanze zu interagieren, sind Trichoderma-Pilze auch in der Lage pflanzenpathogene Schadpilze durch einen Mykoparasitismus genannten Prozess abzutöten. Während dieser mykoparasitischen Interaktion erkennt Trichoderma den Schadpilz spezifisch und durch Weiterleitung der vom Schadpilz stammenden Signale über intrazelluläre Signalkaskaden werden Prozesse ausgelöst die zu dessen Abtöten führen. Beteiligt an diesem mykoparasitischen Angriff ist z.B. die Bildung von Infektionsstrukturen, die Ausscheidung von zersetzenden Enzymen und die Produktion von antifungalen Substanzen (Antibiotika, Toxine). Frühere Untersuchungen dieser Signalkaskaden von T. atroviride deckten eine maßgebliche Rolle von heterotrimeren G-Proteinen und des cAMP- Weges während der Interaktion und dem Angriff des Schadpilzes auf. Um weitere Einblicke in die Rolle der durch G-Proteine vermittelten Signalweiterleitung zu erhalten, wurde das Genom von T. atroviride analysiert, wobei wir mehr als 50 potentielle GPCRs identifizieren und systematisieren konnten. In weiterer Folge wurden ausgewählte für GPCRs kodierende Gene durch Epressionsanalysen und Herstellung entsprechender Trichoderma "Knock- Down"-Mutanten funktionell charakterisiert um herauszufinden ob die jeweiligen Rezeptoren bei der Erkennung von Schadpilzen eine Rolle spielen. Unter den so untersuchten GPCRs stellte sich der Gpr1-Rezeptor als besonders interessant heraus, da entsprechende Mutanten aufgrund einer fehlenden Erkennung des Schadpilzes komplett avirulent waren. Gpr1-Mutanten waren außerdem unfähig antifungale Substanzen zu bilden und auf die Anwesenheit eines Schadpilzes mit der Bildung von zersetzenden Enzymen wie Chitinasen und Proteasen zu reagieren. Weitere Untersuchungen zeigten, daß der Gpr1-Rezeptor für die Ausbildung von Infektionsstrukturen relevant ist und diesen Prozess durch Weiterleitung von vom Schadpilz stammenden Signalen über den cAMP-Weg auslöst. Obwohl der Phänotyp von gpr1-Mutanten jenem von Mutanten denen die Tga1 oder Tga3 G-alpha Proteine fehlen ähnelt, konnte keine direkte Interaktion zwischen Gpr1 und den drei G-alpha Proteinen von T. atroviride bestätigt werden; stattdessen konnten wir neue mit Gpr1 interagierende Proteine isolieren und identifizieren. Die im Laufe dieses Projektes erzielten Ergebnisse über an der Wirtserkennung und dem mykoparasitischen Angriff beteiligten Rezeptoren während der Biokontrolle durch Trichoderma leisten einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Wirkungsweise dieser nützlichen Pilze und könnten in weiterer Folge zur Verbesserung von Trichoderma als biologisches Pflanzenschutzmittel beitragen.