Interaktion zwischen TRPC1 und TRPV6

Transient receptor potential (TRP) Proteine fügen sich zu Kationen-leitenden Kanälen zusammen. Neben homomeren TRP Kanälen, wurden auch heteromere TRP Kanäle, vor allem in homologen Unterklassen, identifiziert. Das einzige TRP Protein das auch mit nicht homologen TRP Kanälen interaktiert ist TRPC1, ein Protein der canonischen TRP Unterklasse. Dieses Projekt untersucht die Interaktion von TRPC1 mit TRPV6, einem Protein der vanilloiden TRP Unterklasse. Für diese Untersuchung kommen verschiedenste Techniken, wie die Patch-Clamp Technik, Fluoreszenz Mikroskopie, aber auch molekulare Kraftmikroskopie zum Einsatz, komplementiert durch biochemischen und molekularbiologische Methoden, die sowohl für in vitro Studien wie auch für Messungen an lebenden Zellen verwendet werden. Es gilt die zellulären/molekularen Konsequenzen einer TRPC1/TRPV6 Interaktion in vivo aufzuklären. Es wird studiert, ob sich ein neuer heteromerer TRPC1/TRPV6 Kanal bildet oder ob TRPC1 eine regulatorische Komponente des TRPV6 Kanals ist. Weiters wird die molekulare Interaktionsstelle des TRPC1/TRPV6 Heteromers analysiert, als auch deren Affinität und molekulare Kraft mit der Interaktionstelle homomerer TRPC1 bzw. TRPV6 verglichen. Dabei spielt der N-terminale Strang beider Proteine eine entscheidende Rolle, da dieser Strukturen für eine Protein-Protein Interaktion beeinhaltet, wie z.B. Ankyrin ähnliche Wiederholungen und eine coiled-coil Domäne. Von großem Interesse ist hierbei molekulare Unterschiede bei homo- wie auch heteromeren Interaktionstellen aufzuklären, um mit Hilfe dominant negativer Fragmente selektiv homo- bzw. heteromere Kanäle zu blockieren. Ein fundiertes Wissen über diese neue Interaktion zwischen TRPC1 und TRPV6 wird dann infolge als Basis für die Aufklärung des speicher-aktivierten Ca2+ Einstroms (SOC) in Prostata Krebszellen verwendet, da sowohl TRPC1 als auch TRPV6 als molekulare Kandidaten für SOC diskutiert werden.

Dieses Projekt war anfänglich auf die Interaktion von TRPC1 und TRPV6, Proteine aus der kanonischen und vanilloiden TRP Familie, fokussiert. Eine mögliche Interaktion wurde ausgehend von speicher-abhängigen Strömen an LNCaP Prostatakrebszellen postuliert, die durch dominant negativ wirkende Spezies beider TRP Proteine gehemmt werden. Dieser Strom an LNCaP Zellen involvierte zusätzlich zwei weitere Proteine, STIM1 und ORAI1, die erst zu Beginn des Projektes als Schlüsselproteine für einen speicherabhängigen Strom in Immunzellen identifiziert wurden. Daher wurde der Fokus dieses Projektes infolge auch auf diese Proteine ausgedehnt, da eine Charakterisierung deren Wechselwirkung relevant für ein Verstehen des speicher-anhängigen Stroms in LNCaP Zellen und auch der Wechselwirkung der TRPC1 und TRPV6 Proteine ist. Der inhibitorische Effekt von TRPC1 konnte auf eine Reduktion des Plasmamembran lokalisierten Anteils an TRPV6 zurückgeführt werden, basierend auf einer dominant negativen Wirkung des N-terminus von TRPC1. Untersuchungen zur Kopplung von STIM1 und ORAI1 benützten in ähnlicher Weise einen kombinierten Einsatz von Techniken wie Patch-Clamp und Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) Mikroskopie komplimentiert durch molekularbiologische und biochemische Studien. Mit FRET Messungen konnten wir erstmalig eine dynamische Wechselwirkung von STIM1 mit ORAI1 charakterisieren. Mit solchen Messungen konnte weiters Einblick in die Zeitabhängigkeit aller essentiellen Signalisierungsprozesse wie Speicherentleerung, STIM1 Multimerisierung bis hin zur STIM1-ORAI1 Kopplung gewonnen werden. Durch beschleunigte Speicherentleerung gelang es sogar die STIM1 Multimerisierung zeitlich getrennt von der Kopplung mit ORAI1 aufzulösen. Wiederauffüllung der Speicher führte wiederum zu einer STIM1-STIM1 und STIM1-ORAI1 Entkopplung. Die dynamische Interaktion von STIM1 und ORAI1 wurde über eine coiled-coil Domäne im C-terminus des ORAI1 vermittelt. So zeigte ein ORAI1 ohne C-Terminus oder mit einer Mutation (L273S) zur Zerstörung der coiled-coil Domäne eine Entkopplung von STIM1. Deletion des N- Terminus von ORAI1 oder Einbau einer Mutation (R91W) die bei einer Immunerkrankung auftritt, ermöglichte noch eine Wechselwirkung mit STIM1, jedoch wurde kein speicherabhängiger Strom mehr induziert. Demnach scheint die coiled-coil Domäne im ORAI1 C-terminus eine Schlüsserolle für die Interaktion mit STIM1 zu spielen. Innerhalb von STIM1 konnten wir im zytosolischen Teil ein ORAI1 aktivierendes minimales Fragment (OAMF) identifizieren, welches ebenfalls zwei coiled-coil Regionen sowie zusätzlich 50 Aminosäuren beeinhaltet. Zusammenfassend gelang es uns, in den zytosolischen Teilen von STIM1 und ORAI1 coiled-coil Regionen zu identifizieren, die essentiell für eine Wechselwirkung der C-Termini beider Proteine verantwortlich sind. Das Verstehen des Kopplungsmechanismus von STIM1 und ORAI1 stellt einen vielversprechenden Ausgangspunkt zur Entwicklung von Medikamenten zur Hemmung speicher-abhängiger Ströme dar.