Molekulare Charakterisierung des EGFR in neuralen Zellen

Mäuse ohne den EGFR (EGFR knock-out Mäuse) zeigen vorwiegend Defekte in Epithelien sowie eine progressive Degeneration von Neurokortex und Olfaktorium, welche massive Apoptose von Neuronen und Gliazellen aufweisen. Der EGFR kontrolliert die normale Entwicklung von Epithelzellen und Astrozyten. Darüber hinaus wurde Amplifikation und Überexpression des EGFR Gens auch in humanen Karzinomen und Glioblastomen, Tumoren epithelialer und glialer Herkunft, beobachtet. Die Erforschung der physiologischen Funktion des EGFR und seiner Signaltransduktion ist von enormer Wichtigkeit, da sie Rückschlüsse auf die Funktion des EGFR unter pathologischen Verhältnissen zulässt. Ziel dieses Forschungsvorhabens ist es, die Funktion des EGFR während der Entwicklung von neuralen Zellen zu untersuchen und die molekularen Mechanismen aufzuklären, die zur Degeneration der Kortex in EGFR knock-out Mäusen führen. Es ist noch ungeklärt, ob die Ursache der kortikalen Degeneration in einem intrinsischen Defekt der Neuronen, einem Defekt der Astrozyten, welche die Neuronen nicht am Leben erhalten können, oder in einer Kombination von beidem liegt. Aktuelle Forschungsergebnisse unserer Gruppe zeigen, dass nur Astrozyten aus der Kortex, nicht jedoch Astrozyten aus dem Mittelhirn durch das Fehlen des EGFR beeinträchtigt werden. Mutante kortikale Astrozyten, im Gegensatz zu solchen aus dem Mittelhirn, können ein Überleben von Neuronen in in vitro Kokulturexperimenten nicht gewährleisten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die mutanten kortikalen Astrozyten nicht genügend Überlebenssignale für Neuronen bereitstellen können, was eine mögliche Erklärung für die Neurodegenration in Abwesenheit des EGFR speziell in kortikalen Hirnarealen bietet. Um diese Hypothese zu bestätigen, planen wir die Mutation des EGFR in verschieden neuralen Zellpopulationen wie Astrozyten, Neuronen oder neuralen Vorläuferzellen. Parallel dazu werden wir transgene Mäuse erzeugen, welche den humanen EGFR in verschiedenen neuralen Zellpopulationen exprimieren. Die Überexpression in Astrozyten, Neuronen oder neuralen Vorläuferzellen von EGFR knock-out Mäusen könnte den durch die Mutation des EGFR verursachten Phänotyp rückgängig machen. Von diesen Mäusen isolierte primäre Zellen werden biochemisch untersucht, um molekulare Mechanismen, die zur Ausbildung des Phänotyps führen, zu analysieren.

Mäuse in denen der Epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) deletiert ist entwickeln einen epithelialen Phänotyp und eine neurodegenerative Erkrankung welche ausschließlich die Astrozyten und Neuronen des frontalen Kortex und des Bulbus Olfaktorius betrifft. Das Ziel dieses Forschungsantrags war es, zelluläre und molekulare Mechanismen zu charakterisieren, die für die kortikale Degeneration der EGFR-Mäuse verantwortlich sind. Experimente unseres Labors haben gezeigt, dass der Mangel an EGFR ausschließlich Auswirkung auf Astrozyten des frontalen Kortex, nicht jedoch auf jene des Mittelhirns hat. In in vitro Ko-kulur Experimenten konnten wir zeigen, dass mutante kortikale Astrozyten, im Gegensatz zu jenen des Mittelhirns, nicht in der Lage sind das Überleben von Neuronen zu unterstützen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin dass kortikale Astrozyten nicht genug Überlebenssignale für die benachbarten Neuronen produzieren und bieten eine Erklärung für das fast ausschließliche Auftreten der kortikalen Neurodegeneration in der Kortex des Gehirns. Um die Bedeutung der einzelnen Zelltypen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Neuronen, für die Entwicklung der Neurodegeneration in vivo zu untersuchen wurden Mäuse, welche konditionelle Allele des EGFR besitzen (EGFR f/f ) mit GFAP-Cre und Nes-Cre transgenen Mäusen verpaart um so den EGFR entweder nur in Astrozyten (EGFR astro ) oder in allen neuronalen Zellen (EGFR np) deletieren zu können. EGFRastro und EGFRnp Mäuse werden lebend geboren, sind aber kleiner als ihre Cre- negativen Geschwister. Im Hippocampus von EGFRastro und EGFRnp Mäusen gibt es, wie in EGFR knock-out Mäusen, ektopische Neuronen. Überraschenderweise entwickelt nur ein kleiner Prozentsatz der EGFRnp Mäuse eine kortikale Neurodegeneration während die Mehrzahl der Mäuse gesund bleibt. Das Ausbleiben der Neurodegeneration liegt wahrscheinlich an der Stabilität des EGFR Proteins, welches, trotz vollständiger Rekombination auf genomischer Ebene, ein Monat nach der Geburt immer noch im Gehirn detektiert werden kann. Das vollständige Verschwinden des Proteins kann erst 3 Monate nach genomischer Deletion des EGFR nachgewiesen werden, was auf eine außerordentliche Stabilität des EGFR Proteins unter physiologischen Ligandenkonzentrationen in vivo hinweist. Diese Hypothese konnte in in vitro Experimenten bestätigt werden, in welchen primäre Astrozyten mit verschiedenen Ligandenkonzentrationen behandelt wurden. Während der EGFR bei hoher Konzentration von EGF degradiert wird rezycliert der EGFR bei niedriger Ligandenkonzentration an die Zelloberfläche. Dies erklärt, warum die Mehrzahl der EGFRastro und EGFRnp Mäuse keine Neurodegeneration entwickelt. Um die Funktion des EGFR im adulten Gehirn zu untersuchen testeten wir die Regenerationsfähigkeit nachdem das Gehirn von EGFRastro und EGFRnp Mäusen durch Stichwunden verletzt wurde. Hier konnten wir zeigen, dass die Wundheilung im Gehirn unabhängig vom EGFR stattfindet. Ebenso zeigt das EGFR-defiziente Gehirn keine Änderung der Neurodegeneration nach einer Infektion mit Prionen. Interessanterweise zeigen Mäuse, in welchen der EGFR im Gehirn fehlt, eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Kainat, einer Substanz, welche Epileptische Anfälle auslöst. Auf der Suche nach einem molekularen Mechanismus konnten wir zeigen, dass EGFR-defiziente Mäuse eine verminderte Expression von Glutamatrezeptoren im Gehirn und in Astrozyten aufweisen, welche für die Wiederaufnahme des Glutamat in die Zelle und damit die rasche Reduktion der überhöhten Glutamatwerte nach Kainatgabe verantwortlich sind.