Glucocorticoid-Apoptose in kindlicher lymphatischer Leukämie

Glucocorticoid (GC) - induzierter Zelltod ist eine zentrale Komponente in der Therapie von Blutkrebs, besonders der akuten lymphoblastischen Leukämien (ALL) bei Kindern. Ein molekulares Verständnis dieses Phänomens und der klinisch wichtigen GC-Resistenz stellen die Voraussetzung für verbesserte Therapieschemata dar. Das Labor des Antragstellers, das zu den weltweit Führenden auf diesem Forschungsgebiet zählt, hat unlängst in einem bislang einzigartigen Suchansatz in Kindern mit ALL zahlreiche "Kandidatengene" identifiziert, deren Expression während der Behandlung mit GC geregelt wurden und deren mögliche funktionelle Rolle bei der GC-induzierten Apoptose nun untersucht werden muss. Zu diesem Zweck sollen im Zuge des beantragten Projektes modernste lentivirale Genexpressionssysteme eingesetzt werden, die eine geregelte Expression bzw. Ausschaltung der in Frage stehenden Kandidatengene in Leukämiezelllinien und Leukämiezellen von Patienten ermöglichen. Dazu sollen neuartige Genklonierungsverfahren ("Gateway System") sowie die unlängst entwickelte RNA- Interferenztechnologie zum Einsatz kommen. Als biologische Systeme für die funktionellen Analysen stehen bestimmte, genetisch veränderte ALL Zelllinien bereits zur Verfügung, weitere sollen im Rahmen dieses Projektes generiert werden. Manche dieser Zelllinien expremieren in regulierbarer Form Gene, die wichtige Prozesse im Tumorgeschehen kontrollieren (wie z.B. Bcl2, p16INK4A, Cyclin D3, c-myc, crmA), sodass die Funktion der untersuchten Kandidatengene in verschiedenen zellulären Zuständen analysiert werden können. Da lentivirale Konstrukte auch ruhende Zellen infizieren können, können solche Konstrukte auch für die Analyse von primär vom Patienten gewonnen Tumorzellen, die sich wenig bis gar nicht teilen, verwendet werden. Mit Hilfe der genannten Systeme soll nun die funktionelle Rolle der wichtigsten GC-regulierten Kandidatengenen aufgeklärt werden. Zusammenfassend sollte das vorgeschlagene Projekt zu einer signifikanten Verbesserung unseres Verständnisses des klinisch hochrelevanten anti-leukämischen GC Effekts führen.

Glukokortikoid (GC) - induzierte Apoptose (Zelltod) ist eine zentrale Komponente in der Therapie der akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL) besonders des Kindesalters. Die Aufklärung der molekularen Grundlage dieses Phänomens und der GC Resistenz sind essentielle Voraussetzungen für Verbesserungen der entsprechenden Therapie. Unsere Arbeitsgruppe hat zahlreiche GC-regulierte Kandidatengene in experimentellen Systemen (Leukemiezelllinien und Mäusethymozyten) und besonders in Lymphoblasten von Kindern mit ALL während GC Monotherapie identifiziert. Zentrales Ziel des vorliegenden Projekts war es, eine mögliche funktionelle Rolle der attraktivsten Gene dieser Gruppe in der Apoptoseinduktion zu untersuchen. Zu diesem Zweck stellten wir lentivirale Expressionssysteme zur konditionellen (Tetrazyklin-geregelten) Genüberexpression und/oder Gen "knock-down" mittels RNA Interferenz mit kleine "hairpin RNAs" für folgende Gene her: NR3C1/GR (der GC Rezeptor), PFKFB2 (2 Spleißvarianten), ZBTB16, SLA, SOCS1, SNF1LK/SIK1, TSC22D3/GILZ und RGS18 (ein Kandidatengen für GC-Resistenz, das im Zuge dieses Projekt entdeckt wurde). Mit diesen Konstrukten analysierten wir die funktionelle Rolle der entsprechenden Gene in kindlichen ALL Zelllinien (CCRF-CEM, NALM6, PreB697). In einem Fall (SIK1) wurden auch in Zusammenarbeit mit J. Penninger in Wien "knock-out" Mäuse generiert. Mit der Ausnahme des GRs, der sich als zentraler Faktor für GC-Empfindlichkeit und die Kinetik der GC-induzierten Zelltodantwort herausstellte, erwies sich keines der untersuchten Gene als Schlüsselspieler für die antileukämischen Effekte der GCs. Somit stellt sich, zumindest gegenwärtig, die Regulation von Mitgliedern der großen BCL2 Familie (einer Gruppe von Zelltod-regulierenden Proteinen, die wir hauptsächlich in einem parallelen Projekt untersucht haben), als das kritischste Ereignis für die Zelltodinduktion dar. Einige der hier untersuchten "Spitzenkandidaten" zeigten eine modulierende Rolle, wie etwa die PFKFB2 Spleißvariante 15B, die die Zellen empfindlicher für GC-induzierte Apoptose machte, oder ZBTB16, welches überraschenderweise einen schützenden Effekt zeigte. Andere klar GC-regulierte Gene könnten für andere GC-Effekte verantwortlich sein, wie etwa SLA, das eine wichtige Rolle in der immunsuppressiven Aktivität der GC spielen könnte. Die diversen Konstrukte, Zelllinien und "knock-out" Mäuse, die am Rahmen dieses Projekts generiert wurden, stellen wertvolle Werkzeuge für künftige Untersuchungen dieser Effekte dar.