Initiation des Plasmidtransfers

Bakterielle Konjugation ermöglicht die Übertragung von genetischer Information von einer lebenden Bakterienzelle zur nächsten. Dieser grundlegende Mechanismus des horizontalen Gentransfers ermöglicht die Adaption und Evolution von Mikroorganismen, trägt darüber hinaus aber wesentlich zur Verbreitung und Persistenz bakterieller Infektionen bei. Zum einen kodieren die transportierten zirkulären DNA-Moleküle (Plasmide) zusätzlich zu den für die eigene Übertragung notwendigen Proteinprodukte häufig für Antibiotikaresistenzen und/oder Virulenzfaktoren. Des weiteren erlaubt die plasmid-kodierte Ausbildung eines Filaments (Pilus) an der Zelloberfläche von Gram- negativen Bakterien nicht nur die anfängliche Kontaktaufnahme mit einer Empfängerzelle und den darauffolgenden DNA Transport, diese Pili steigern auch die Fähigkeit der Bakterien, oberflächenhaftende Biofilme bilden zu können. Einmal gebildet, zeigen die Zellen in diesen Biofilme eine erhöhte Resistenz gegenüber dem Immunsystem als auch gegenüber Antibiotikatherapie. Die Expression der für die Pilussynthese notwendigen Gene ist zwar unter normalen Umständen gehemmt, unbekannte Mechanismen erlauben jedoch das Überwinden dieser Expressionskontrolle in einigen plasmidtragenden Zellen, die Ausbildung der Pili und die anschließende Verbreitung der Plasmide innerhalb von Bakterienpopulationen. Die Identifizierung und Untersuchung der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind Gegenstand dieses Forschungsvorhabens. Die Ergebnisse vorhergehender Studien unserer Arbeitsgruppe bilden die Basis für das jetzige Forschungsvorhaben, das auf zwei parallele experimentellen Ebenen aufbaut: Auf Populationsebene wird mittels repräsentativer konjugativen Plasmide, dem Modellorganismus Escherichia coli und neu entwickelten Reporterkonstrukten die Expression von plasmid-kodierten Genen in Abhängigkeit von Zell-Zellkontakt bestimmt werden. Auf molekularer Ebene werden biochemische Studien die Identifizierung jener entscheidenden Protein-Protein und Protein-DNA Wechselwirkungen erlauben, die den Schlüsselschritt bei der Initiation des Plasmidtransfers kontrollieren und steuern. Beide Ansätze werden auch in Hinblick auf die Entwicklung neuer Therapieansätze einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der Mechanismen führen, die zur Verbreitung von Antibiotikaresistenzen aber auch zur verstärkten Biofilmbildung beitragen.

Bakterielle Genome sind im Vergleich zu denen anderer Organismen wesentlich kleiner und tragen eine geringere Anzahl von Genen. Um den daraus resultierenden Nachteil zu kompensieren sind Bakterien in der Lage DNA zwischen nahverwandten aber auch artfremden Zellen auszutauschen. Solche mobilen DNA-Moleküle (Plasmide, Phagen oder Transposons) sind typischerweise mit einem Arsenal an Genen ausgestattet, die für das Überleben der Bakterien einen entscheidenden Vorteil bringen, z.B. Antibiotika-Resistenzen und Virulenz-Faktoren. Somit ist dieser horizontale Gentransfer zwischen Bakterien die Hauptursache für die massiv ansteigenden Resistenzen gegen konventionelle Antibiotika-Therapien. Eine wichtige Rolle im horizontalen Gentransfer spielt die bakterielle Konjugation, bei der durch direkten Zell-Zellkontakt Plasmide von einer Donor- auf eine Rezipientenzelle übertragen werden. Dafür synthetisieren die Donoren einen hochspezialisierten membrandurchspannenden Proteinkanal, der eine physische Verbindung zwischen den Zellen herstellt und aktiv die DNA in den Rezipienten transportiert. Dieser Kanal hat sich im Laufe der Evolution dahingehend angepasst, dass nicht nur DNA sondern auch Proteine direkt in menschliche, tierische oder pflanzliche Zellen transportiert werden. Viele pathogene Bakterien nutzen diese Art des Proteintransfers um erfolgreich ihren Infektionszyklus einzuleiten oder zu unterstützen. Daher ist die medizinische und ökonomische Bedeutung dieses Sekretionsprozess von enormer weltweiter Signifikanz und ein besseres Verständnis wird benötigt um schlussendlich kontrollierend in diesen Prozess eingreifen zu können. Unser Labor beschäftigt sich mit der Klärung dieses Protein- und DNA-Sekretionsprozesses, mit einem speziellen Fokus auf die frühen Initiations-Schritte des Transfers im Donor. Um die involvierten Mechanismen aufzuklären verwenden wir biochemische, genetische, strukturbiologische und bioinformatische Analysen. In beiden Fällen - beim konjugativen DNA- sowie beim mit Virulenz assoziierten Protein-Transfer - kontrolliert ein Protein- abhängiger Erkennungsschritt, der spezifisch die zu transportierenden Substrate identifiziert, den Transferstart. Das für diese Erkennung notwendige Rezeptorprotein wird als "coupling protein" bezeichnet. Zusätzlich zur Erkennung reguliert dieses "coupling protein" den Zugang des Substrats zum Sekretionskanal und liefert die Energie um die Substrate durch den Kanal zu schleusen. Projekt P18607 führte zur Identifikation spezifischer Bereiche eines Substratproteins, die es ihm erlauben erkannt und transportiert zu werden. Unserem Labor gelang als Erstes eine detaillierte Beschreibung der Struktur und der Funktion eines solchen Erkennungsbereiches. Des Weiteren konnten wir dessen weite Verbreitung in unverwandten Substratproteinen nachweisen und zusammen mit der Struktur- Funktion Analyse erfolgreich publizieren. Das neugewonnene Wissen wurde mit umfangreichen biochemischen Analysen kombiniert um die verschiedenen Kontrollschritte des Transferstarts abzuklären und deren Einfluss auf das "coupling protein" zu untersuchen, die schlussendlich die Aktivierung des Sekretionskanal zur Folge hat. Die entdeckten regulatorischen Interaktionen liefern uns ein neuartiges Verständnis für die Initiation des Transferprozesses und bieten neue Ansätze für einen kontrollierten Eingriff in diesen Prozess.