Nucleotid Analog Interferenz im Ribosom

Das Ribosom ist ein essentielles Enzym mit alter evolutionärer Vergangenheit und nimmt im Zellmetabolismus eine zentrale Rolle ein. Das Ribosom, ein multifunktionelles Ribonukleoprotein (RNP) Partikel, ist für die Proteinsynthese in allen lebenden Zellen zuständig. Da das Ribosom der Hauptangriffspunkt der meisten natürlich vorkommenden Antibiotika ist, ist dessen funktionelles Verständnis von potentieller Bedeutung für die Bekämpfung von Antibiotika Resistenzen und für die Erzeugung neuer anti-mikrobieller Substanzen. Die Kristallstrukturaufklärung des Ribosoms brachte soetwas wie einen Quantensprung in unser Verständis der ribosomalen Organisation. Diese Studien bestätigten, dass das Ribosom ein RNA Enzym ist, da alle funktionell wichtigen Regionen nahezu ausschliesslich von ribosomaler RNA (rRNA) aufgebaut sind. Trotz detailierter Einsicht in die Struktur des Ribosoms, sind die katalytischen Mechanismen der beiden Hauptreaktionen der grossen ribosomalen Untereinheit (Peptidbindung und Peptid release) und die genauen Details der tRNA Translokation, auf der molekularen Ebene noch nicht aufgeklärt. Ziel dieses Forschungsprojektes ist es, das aktive Zentrum der grossen ribosomalen Untereinheit chemisch zu modifizieren. Dabei wird eine kürzlich entwickelte Methode zur Anwendung kommen (die `gapped-cp- reconstitution`) die es erlaubt, stellenspezifisch chemisch modifizierte RNA Nukleoside in die rRNA der grossen ribosomalen Untereinheit einzubauen. Diese Vorgangsweise vergrössert signifikant den pool an chemisch unterschiedlichen Gruppen, die spezifisch in die grosse ribosomale Untereinheit eingebracht werden koennen. Im Vergleich dazu ist die Standard Mutagenese nur auf die drei natürlichen Basen Mutationen beschränkt. Mit dem hier beschriebenen neuen Ansatz können die funktionellen Auswirkungen dieser Nukleosid Modifikationen auf fundamentale ribosomale Reaktionen, wie die Peptidbindung, den Peptid release, oder die Translokation mit bis dato unbekannter Präzision untersucht werden.

Im Rahmen dieses Forschungsprojektes haben wir eine kürzlich entwickelte experimentelle Methode (die gapped- cp-reconstitution`) angewendet, die es uns erlaubte, stellen-spezifisch nicht-natürliche RNA Bausteine in das kaltalytische Herz des Ribosoms einzubauen. Biochemische und neueste kristallographische Daten zeigten, dass das katalytische Zentrum der grossen ribosomalen Untereinheit (das Peptidyltransferase Zentrum) ausschliesslich aus 23S ribosomaler RNA aufgebaut ist. Das bedeutet, dass die beiden Hautreaktionen der Protein Biosynthese, die Peptid-Bindung und die Peptid-Freisetzung, durch einen rRNA katalysierten Mechanismus bewerkstelligt werden. Da Ribosomen von so fundamentaler Wichtigkeit für das Leben sind und auch den Hauptangriffspunkt für die meisten klinisch relevanten Antibiotika darstellen, ist das molekulare Verständnis der Ribosomen von entscheidender molekularbiologischer Bedeutung. Vorangegangene Mutationsstudien an allen potentiell katalytischen Nukleotiden des Peptidyltransferase Zentrums konnten die katalytischen Mechanismen während der Proteinsynthese nicht restlos aufklären. Offensichtlich ist das chemische Repertoir das durch den Einbau natürlicher Basenmutanten erzielt werden kann, nicht ausrechend, um die Peptid-Bindung und die Peptid-Freisetzung auf dem molekularen Ebene zu verstehen. Der neue experimentelle Ansatz erlaubte es uns nun jedoch, gezielt einzelne chemische Gruppen und sogar einzelne Atome zu verändern. Diese Vorgangsweise vergrössert signifikant den Pool an chemisch unterschiedlichen Gruppen, die spezifisch in das Ribosom, ein Enzym mit ca 1.8 MD Grösse, eingebracht werden können. Es stellte sich heraus, dass eine einzige chemische Gruppe, das 2`-Hydroxyl des Ribose Zuckers an der Position A2451 der 23S rRNA, entscheidend für die Peptid-Bindung ist. Im Gegensatz dazu zeigten wir, dass ein intakter Zuckerrest an der Position A2602 wesentlich für die Peptid-Fresetzung ist, wobei ihm keine wesentliche Rolle während der Peptid Bindung zukommt. Diese Daten verdeutlichen, dass die katalytischen Mechnansimen der Peptid-Bindung und der Peptid-Freisetzung unterschiedlich sind. Es ist weiters hervorzuheben, dass in beiden vom Ribosom katalysierten Reaktionen, das Ribosom jeweils eine rRNA Rückgrad Gruppe zur Verfügung stellt, jedoch keine Gruppe an den Basen, obwohl diese universell konserviert sind.