Struktur Funktionsanalysen in Katalase Peroxidasen

Peroxidasen katalysieren die vielfältigsten biochemischen Reaktionen. Neben der Entsorgung von toxischen Peroxiden in der Zelle sind sie an der Lignin Biosynthese (einem der häufigsten Biopolymere der Erde), an der unspezischen Immunabwehr des Menschen (Abtöten von pathogenen Eindringlingen) oder beispielsweise an Hormonbiosynthesen (z.B. in der Schilddrüse) beteiligt. Katalase-Peroxidasen sind die einzigen Vetreter, die neben ihrer Peroxidaseaktivität eine Katalaseaktivität haben, wie sie sonst nur in sog. (monofunktionellen) Katalasen anzutreffen ist. Katalase-Peroxidasen sind also multifunktionell und können eine Vielzahl von Substraten entweder in Einelektronen- oder Zweielektronenschritten oxidieren. Sie sind daher ideale Enzymsysteme um Struktur- Funktionsbeziehungen in Häm-enthaltenden Oxidoreduktasen zu studieren. In den letzten Jahren konnte die dreidimensionale Struktur dieser Enzyme in kristalliner Form erfolgreich ermittelt werden. Zudem wurden zahlreiche aussergewöhnliche strukturelle Besonderheiten entdeckt. Der Wiener Arbeitsgruppe ist es durch ortspezifische Mutagenese gelungen zahlreiche interessante Mutanten mit dramatisch veränderter Funktionalität herzustellen und zu zeigen, dass im Zuge der enzymatischen Aktivität zwei Proteinradikale entstehen. In diesem Projekt sollen nunmehr mit Hilfe der ortspezifischen Mutagenese in Kombination mit modernsten schnell messenden Verfahren der Enzymkinetik und spektroskopischen Methoden, wie z.B. Hochfeld-Elektronenspin- Resonanz-Spektroskopie von gezielt markierten (deuterierten) Enzymen, Resonanz Raman Spektroskopie und Röntgenkristallographie, jene strukturellen und funktionellen Eigenschaften erforscht werden, die es einem Enzym erlauben sowohl Zweielektronen-Oxidationen (z.B. Oxidation von Wasserstoffperoxid zu molekularem Sauerstoff oder Oxidation von Bromid zu Hypobromit) als auch Einelektronen-Oxidationen ähnlich effizient zu katalsysieren. Dabei soll die Rolle der Bildung und Reaktivität von Proteinradikalen und das Design des aktiven Zentrums und der Substratkanäle im Hinblick auf diese Reaktivitäten untersucht werden. Durch Kombination der oben angeführten hochmodernen Techniken sollte es schließlich möglich sein, den Reaktionsmechanismus dieses interessanten Enzyms aufzuklären. Da Peroxidasen in der chemischen Industrie, in der Biotechnologie und in der biochemischen-medizinischen Analytik zu den am häufigsten verwendeten Enzymen gehören, liefern diese Forschungsergebnisse auch die entscheidende Grundlage für ein rationales Design von Varianten mit veränderter Funktionalität, wodurch sich die Anwendungsbereiche dieser Biokatalysatoren erweitern werden.

Peroxidasen katalysieren die vielfältigsten biochemischen Reaktionen. Neben der Entsorgung von toxischen Peroxiden in der Zelle sind sie an der Lignin Biosynthese (einem der häufigsten Biopolymere der Erde), an der unspezischen Immunabwehr des Menschen (Abtöten von pathogenen Eindringlingen mittels Leukocyten) oder beispielsweise an Hormonbiosynthesen bei Säugetieren (z.B. in der Schilddrüse) oder in Pflanzen beteiligt. Katalase-Peroxidasen sind die einzigen Vetreter, die neben ihrer Peroxidaseaktivität eine Katalaseaktivität haben, wie sie sonst nur in sog. (monofunktionellen) Katalasen anzutreffen ist. Katalase-Peroxidasen (KatG) sind also multifunktionell und können eine Vielzahl von Substraten entweder in Einelektronen- oder Zweielektronenschritten oxidieren. Sie sind daher ideale Enzymsysteme um Struktur-Funktionsbeziehungen in Häm-enthaltenden Oxidoreduktasen zu studieren. In den letzten Jahren konnte die dreidimensionale Struktur von vier KatGs in kristalliner Form erfolgreich ermittelt werden. Zudem wurden zahlreiche aussergewöhnliche strukturelle Besonderheiten entdeckt. In diesem Projekt konnte die Wiener Arbeitsgruppe durch ortspezifische Mutagenese zahlreiche interessante Mutanten mit dramatisch veränderter Funktionalität herstellen. Mittels dieser KatG- Varianten in Kombination mit der Anwendung zahlreicher biochemischer und biophysikalischer Methoden konnte erstmals ein umfassendes Bild über den Zusammenhang von Struktur und Peroxidase- bzw. Katalase-Aktivitäten in diesen Enzymen erhalten werden. Mit Hilfe von schnell messenden Verfahren der Enzymkinetik und spektroskopischen Methoden, wie z.B. Hochfeld-Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie, der Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie und spektroelektrochemischen Untersuchungen, konnte der Einfluss der Proteinmatrix und der außergewöhnlichen KatG-spezifischen posttranslationalen Modifikationen auf die Bifunktionalität dieser Modellenzyme aufgeklärt werden. Die strukturellen Anforderungen an ein dismutierenden Enzyms, das Wasserstoffperoxid sowohl reduziert als auch oxidiert, sowohl hinsichtlich der Architektur des aktiven Zentrums, als auch des Substratkanals, und somit Ähnlichkeiten und Unterschiede zu monofunktionalen Peroxidasen und Katalasen konnten in zahlreichen Publikationen dargestellt werden. Da Peroxidasen und Katalasen in der chemischen Industrie, in der Biotechnologie und in der biochemischen- medizinischen Analytik zu den am häufigsten verwendeten Enzymen gehören, liefern diese Forschungsergebnisse auch die entscheidende Grundlage für ein künftiges rationales Design von Varianten mit veränderter Funktionalität, wodurch sich die Anwendungsbereiche dieser Biokatalysatoren erweitern werden.