Bildung und Mobilisierung von Neutrallipiden in Hefe

In den verschiedensten Zelltypen werden die Neutrallipide Triacylglycerol (TAG) und Sterolester (STE) in Form sog. Lipidpartikel gespeichert. Auch die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, die als eukaryontisches Modellsystem dient, enthält derartige Strukturen. Neutrallipide sind dynamische Komponenten, die einerseits als Energiespeicher dienen, aber anderseits auch Bausteine (Fettsäuren, Sterole) für die Bildung zellulärer Membranen liefern. In den letzten Jahren gelang es, erste Einblicke in die Molekularbiologie der Lipiddepot-Bildung zu erlangen. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae hat sich dabei als wertvolles experimentelles System erwiesen und die Identifizierung der meisten Enzyme der TAG und STE Synthese und Hydrolyse ermöglicht. Der nächste Schritt zum biologischen Verständnis der Entstehung bzw. Mobilisierung der Neutrallipid-Depots muss nun die Aufklärung der Mechanismen sein, die an diesen Prozessen beteiligt sind. Der vorliegende Projektantrag beschreibt Strategien, um (i) die physiologische Rolle der Lipiddepots zu studieren, (ii) die molekulare Funktion der Genprodukte zu charakterisieren, die an der TAG und STE Bildung bzw. Mobilisierung in der Hefe Saccharomyces cerevisiae mitwirken, sowie (iii) neue Gene zu identifizieren, die an diesen Biosynthesewegen beteiligt sind. Basierend auf früheren und derzeit laufenden Arbeiten sollen Neutrallipid synthetisierende und hydrolysierende Enzyme genauer studiert werden. Mit Einzel- oder Mehrfach-Mutanten kann der Beitrag der einzelnen Enzyme zur Bildung der Lipidpartikel untersucht werden. Die Lipid-Profile der Totalzellextrakte oder isolierter Organellen dieser Mutanten werden Rückschlüsse auf das komplexe Netzwerk der Neutrallipid-Homöostase ermöglichen. Dem Wechselspiel des Endoplasmatischen Reticulums mit Lipidpartikeln, den beiden Orten der Neutrallipid-Synthese, wird besonderes Augenmerk zu schenken sein. In Analogie zu TAG- und STE-Synthasen scheinen auch TAG-Lipasen und STE-Hydrolasen verschiedene Beiträge zur Mobilisierung von Neutrallipiden zu liefern. Wiederum kann mit Hilfe von Einzel- und Mehrfachmutanten die spezifische Rolle und die physiologische Relevanz der einzelnen Enzyme studiert werden. Im Zuge dieser Untersuchungen erwarten wir auch die Identifizierung von Helfer-Proteinen, die den Zugang der TAG- und STE-spaltenden Enzyme zu ihren in den Lipidpartikeln gespeicherten Substraten ermöglichen. Die Identifizierung solcher Genprodukte wird durch eine Analyse des Proteoms der Lipidpartikel sowie bioinformatische und funktionelle Analyse erfolgen. Schließlich beabsichtigen wir, zellbiologische Konsequenzen von TAG bzw. STE Mangel oder Überproduktion zu studieren. Der Schwerpunkt dieser Untersuchungen soll auf einer möglichen Schutzfunktion der Neutrallipide für Proteine vor Abbau und der möglichen Rolle der Lipidpartikel als Depot für unpassende Fettsäuren liegen, die dem Bildungsprozess biologischer Membranen entzogen werden. In Summe werden diese Experimente unser Verständnis für die Rolle der Neutrallipide in Hefe erweitern, aber auch Rückschlüsse auf höhere Organismen, z.B. den Menschen, zulassen.

In Hefezellen können die Neutrallipide TAG (Triacylglycerole) und STE (Sterolester) in sogenannten Lipidpartikeln (lipid droplets) gespeichert werden. Bei Bedarf werden TAG und STE mobilisiert, und die freigesetzten Fettsäuren als Bausteine für die Synthese von Membranlipiden verwendet. Das Ziel des vorliegenden Projekts war es die enzymatischen Schritte zu untersuchen, die zur Mobilisierung von TAG und STE beitragen. Für diese Experimente wurden biochemische, molekularbiologische und zellbiologische Methoden herangezogen. Eine wichtige Erkenntnis dieses Projekts war, dass die drei TAG-Lipasen der Hefe, Tgl3p, Tgl4p und Tgl5p, den metabolischen Fluss langkettiger Fettsäuren aus den TAG Depots in die Synthese von Sphingolipiden und Phospholipiden beeinflussen. Durch diesen Mechanismus tragen diese TAG-Lipasen wesentlich zur Synthese und Re-Modellierung komplexer Lipide bei. Im Zuge dieser Untersuchungen stellten wir fest, dass die TAG-Lipasen der Hefe nicht nur Lipolyse katalysieren, sondern auch als Lysophospholipid-Acyltransferasen fungieren können. Daher sind diese Proteine auch im anabolischen Netzwerk der Lipidsynthese eingebunden. Ein weiterer Aspekt, der in diesem Projekt behandelt wurde, war die Proteom- und Lipid-Ausstattung der Lipidpartikel. Mit Hilfe von Massenspektrometrie wurden neue Lipidpartikel-Proteine identifiziert und der Einfluss wechselnder Kulturbedingungen auf die molekulare Ausstattung der Lipidpartikel untersucht. Biophysikalische Untersuchungen brachten Hinweise auf die interne Struktur der Lipidpartikel. Unter eine monomolekularen Schicht von Phospholipiden befinden sich mehrere schalenartige Schichten, die aus STE bestehen, welche wiederum einen Kern unorganisierter TAG Moleküle umschließen. Wir konnten auch zeigen, dass sich unter lipotoxischem Stress hervorgerufen durch Wachstum der Hefe auf Ölsäure die Depotbildung der Fettsäuren in Form von TAG und STE verändert. Spezifische regulatorische Mechanismen der TAG und STE Synthese wurden evident, die zu morphologischen Veränderungen und zur Anpassung der Lipidzusammensetzung führten. Schließlich konnten wir zeigen, dass unter bestimmten Bedingungen Squalen, eine Sterol-Vorstufe, auch als Depot-Lipid dienen kann. Interessanterweise findet man Squalen nicht nur in Lipidpartikeln, sondern auch in zellulären Membranen eingelagert. Zusammenfassend führte dieses Projekt zu neuen Erkenntnissen über Lipid-Depotbildung und Lipid- Mobilisierung sowie zur Rolle der Enzyme, die an diesen Prozessen beteiligt sind.