Funktionsselektive Proteinfänger - Nanooberflächen

Ziel der Arbeiten ist die Herstellung verlässlicher und billiger Systeme zur Detektion von Glycosidasen die einen breiten Anwendungsspielraum für Biochemie, Medizin und "functional proteomics"-Forschung bieten. REVERSIBLE Glycosidasenhemmer, die Fluoreszenzindikatoren tragen, werden synthetisiert, ihre biologische Aktivität wird untersucht, ihre Anwendbarkeit in obigem Zusammenhang in einfachen Modellen getestet und sie werden schliesslich an eine Chip-Oberfläche gekuppelt. Inkubierung mit Reinenzymen, Mischungen oder ungereinigten Lysaten erzeugt "Bindungsereignisse", die mittels Fluoreszenzspektrometrie festgestellt und beobachtet werden können. Darauf aufbauend, ist unter anderem die Herstellung eines Glycosidasen-Atlas möglich, der die einzigartigen Wechselwirkungen des jeweiligen Enzyms mit den verschiedenen Inhibitoren auf dem Chip wie einen Fingerabdruck dokumentiert und für verschiedenste Anwendungen zur Verfügung hält. Auf der Basis eines zu demonstrierenden, eindeutigen "Proof of Concept" kann die Methode für verschiedenste Zwecke eingesetzt werden. Zum Beispiel sind "Virale Enzymchips" (für Grippe, Herpes oder HIV), Chips für "Erbliche Stoffwechselstörungen" (Hirnstoffwechsel, Proteinglycosylierungsdefekte) oder "Tumor-Enzyme-Chips" möglich. Durch die Anwendung reversibler Enzymhemmer an der Chip-Oberfläche können auch "Schnappschüsse" des zeitlichen Bindungsverlaufes gemacht werden. Auf demselben Prinzip beruht die mögliche mehrmalige Verwendung des Chips (im Gegensatz zu "Ein-Weg"-Techniken) die weitere diagnostische Möglichkeiten eröffnen, aber auch Vorteile bei der "Kostenreduktion" in "low-budget"-Situationen (NGOs, arme Länder oder Gesellschaftsschichten) bringen können.

Das Projekt bschäftigte sich mit dem Design, der anschliessenden Synthese und biologischen Evaluierung neuer Glycosidasenhemmer mit dem Ziel, diese auf Chips aufzubringen und damit Proteine mit Glycosidaseneigenschaften rasch und effizient zu detektieren und einzuordnen. Auf vorangegangenen erfolgreich verlaufenen Arbeiten aufbauend, in deren Verlauf lösliche fluoreszenzmarkierte Enzymhemmer für die Detektion und Charakterisierung von Glycosidasen hergestellt worden waren, wurde nun versucht, mit einem zweiten "Haltegriff" im Molekül die Anbindung des Wirkstoffs an die Oberfläche des Chips zu ermöglichen. Als "Proof- of-concept" wurden nach zahlreichen Strukturoptimierungen unterschiedliche Inhibitoren mit verschiedenen Wirkcharakteristika auf den Chip aufgebracht und mit fluoreszenzmarkierten Glycosidasen inkubiert. Wie erhofft, zeigte sich, dass die hohe Aktivität und Selektivität der Inhibitoren in Lösung auch an der Glasoberfläche erhalten blieb und dass der jeweilige Inhibitor nur die für ihn charakteristischen Enzyme festhielt. In einem erfreulichen Spin-off konnte weiters geziegt werden, dass die neu hergestelllten Verbindungen als starke Inhibitoren lysosomaler Gylcosidasen wirken, welche für den Katabolismus zahlreicher Liposaccharide und Polysaccharide lebensnotwendig sind. Erblicher Mangel an Aktivität dieser wichtigen Enzyme erzeugt ernste Krankheiten wie zum Beispiel Gaucher-, Fabry-, Sandhoff- und etwa vierzig weitere weniger bekannte Syndrome. Der Grund für den Aktivitätsmangel stellen Mutationen des Proteinstranges dar wodurch sich die betroffenen Enzyme nicht mehr korrekt falten können um aktiv zu werden wodurch das jeweilige Substrat sich ansammelt und in den Zellen als Plaques ablagert. Die Folge sind Organschwellungen, Nervenzerstörung oder Knochenschäden. In Gegenwart geringer Inhibitor-Konzentrationen, die nicht enzymhemmend wirken, können sich nun diese schlecht gefalteten Enzyme um den Inhibitor falten, der dann wieder ausgestossen wird und gewinnen einen Teil ihrer Normalaktivität zurück. Dies führt in der Regel zu einem Rückgang der genannten, jeweils krankheitstypischen Symptome. Mit den von uns bisher hergestellten und getesteten Wirkstoffen konnten kürzlich in für Testzwecke isolierten Zellen von Patienten bis zu 18fache Enzymaktivitätssteigerungen gemessen werden. Dies sollte eine ermutigende Basis für weitere Forschungsarbeiten darstellen.