S-Schicht-Glykosylierungsenzyme für die Nanobiotechnologie

Glykoproteine sind ubiquitäre Biomoleküle, die an vielen wichtigen biologischen Prozessen beteiligt sind, wobei die assoziierten Glykane oft der Schlüssel zur biologischen Funktion sind. Demzufolge wird die junge Technologie des "Glykan-Engineering", mit deren Hilfe man massgeschneiderte Glykoproteine generieren kann, die Möglichkeiten, komplexe biologische Prozesse zu beeinflussen oder zu kontrollieren, entscheidend erweitern. Auf Grund der Komplexizität der Glykoprotein-Biosynthese in höheren Organismen, waren Glykoproteine bisher für biotechnologische Anwendungen nicht zugänglich. Der kürzlich erfolgte funktionelle Transfer von Glykoprotein- Biosynthesewegen in das Modell-Bakterium Escherichia coli eröffnet nun neue Perspektiven für das "Glykan- Engineering". In diesem Projekt soll der O-Glykosylierungsweg des S-Schichtglykoproteins des Gram-positiven Bakteriums Geobacillus stearothermophilus NRS 2004/3a als Ausgangspunkt für "Glykan-Engineering" in E. coli Zellen herangezogen werden. Die Attraktivität dieses Vorhabens besteht darin, dass hier zum ersten Mal "Glykan- Engineering" an einem selbstassemblierenden S-Schichtglykoprotein durchgeführt wird. Dies kann zur periodischen Präsentation von "intelligenten Glykanmotiven" in dichtester Packung und mit Nanometer-Präzision ausgenützt werden, wodurch sich neue Möglichkeiten in der Nanobiotechnologie und Biomedizin eröffnen, wie beispielsweise die Funktionalisierung von Oberflächen oder das Design neuartiger Glykan-Vakzine. Das geplante Vorhaben basiert auf dem detaillierten Verständnis der Schlüsselmodule des S-Schichtprotein Glykosylierungsprozesses, das sind das Initiationsenzym und die Oligosaccharid: Protein-Transferase. Die O- Glykosylierung des S-Schichtproteins von G. stearothermophilus NRS 2004/3a wird durch einen chromosomalen Gencluster kodiert und verwendet einzelne Module aus dem Assemblierungsweg der Lipopolysaccharide von Gram-negativen Bakterien. Ausgehend von den Ähnlichkeiten dieser beiden Biosynthesewege, und basierend auf der Erforschung der beiden Schlüsselmodule der S-Schichtptrotein Glykosylierung, welche im Rahmen dieses Projekts erfolgen wird, sollte der heterologe Transfer von Glykanen auf die bekannten Glykosylierungsstellen des S-Schichtproteins möglich sein. Zur Charakterisierung der Schlüsselmodule und zur Testung unserer Hypothese, beinhalten unsere Forschungsziele: A) Charakterisierung des Initiationsenzyms der S-Schichtglykan-Biosynthese in G. stearothermophilus NRS 2004/3a. Dies ist umso interessanter, als jüngste Ergebnisse duale Spezifität dieses Enzyms vermuten lassen. B) Heterologe Produktion eines S-Schichtglykoproteins mit authentischen S- Schichtglykanen in E. coli, zur Überprüfung der Funktion der S-Schicht-Glykosylierungsmaschinerie im Wirtsorganismus. C) O-Glykosylierung des S-Schichtproteins mit ausgewählten O-Antigenen. D) Untersuchungen zur Spezifität der Oligosaccharyl: Protein-Transferase, indem dem Enzym verschiedene Lipid-gebundene Oligosaccharide als Substrate angeboten werden.

Auf Grund der Unkompliziertheit von Bakterien erfahren bakterielle Glykosylierungs-Systeme immer mehr Bedeutung, um in ihnen mittels Glykosylierungs-Engineering biologisch-aktive Glykoproteine herzustellen. Voraussetzung dafür ist das Verständnis der komplexen Glykoprotein-Biosynthese; ein Mangel daran hat bisher die biotechnologische Nutzung dieser Systeme verhindert hat. Glykoproteine, und hier vor allem S- Schichtglykoproteine, findet man auf vielen Bakterienzellen. S-Schichtglykoproteine haben die bemerkenswerte Eigenschaft, durch Selbstorganisation 2D-Gitter auszubilden, was sie zu idealen Matrices für die Präsentation von Glykanen mit nanometerskaliger Genauigkeit macht. Derartige Glyko-Biomaterialien haben ein großes Anwendungspotenzial in der (Nano)Biotechnologie und Biomedizin. In diesem Projekt sollte die Möglichkeit des Glykosylierungs-Engineering basierend auf dem S-Schicht O- Glykosylierungsweg des Bakteriums Geobacillus stearothermophilus NRS 2004/3a gezeigt werden. Basierend auf dem detaillierten Verständnis von Schlüsselkomponenten dieses Weges und auf Grund der postulierten Ähnlichkeit dieses Weges mit anderen bakteriellen Glykosylierungswegen, sollte durch einen Austausch einzelner Komponenten die Produktion eines S-Schichglykoproteins mit "maßgeschneiderter" Glykosylierung in einer geeigneten bakteriellen Zellfabrik gezeigt werden. Die wesentlichen Erkenntnisse aus diesem Projekt sind: (i) Ein klares Bildes über den enzymatischen Ablauf der S-Schichprotein-Glykosylierung in den Modellorganismen Geobacillus stearothermophilus NRS 2004/3 und Paenibacillus alvei CCM 2051. Mittels Röntgenstrukturanalyse und molekular-dynamischer Simulation konnte erstmals Einblick in die Struktur-Funktionsbeziehung einzelner Glykosylierungsenzyme gewonnen werden. (ii) S- Schichtglykosylierungs-Module können zwischen Glykosylierungssystemen ausgetauscht und somit für Glykosylierungs-Engineering verwendet werden. Das S-Schichtprotein kann durch Protein-Engineering in eine Matrix für beliebige Glykane verwandelt werden. Dies konnte durch die Produktion von S-Schichtproteinen, die entweder mit einem Heptasaccharid von Campylobacter jejuni oder dem E. coli O7 Antigen glykosyliert waren, gezeigt werden. (iii) Ein neuartiger Biokatalysator mit verbesserten Eigenschaften im Vergleich zum löslichen Enzym wurde hergestellt, indem Liposomen mit einem Fusionsprotein aus S-Schicht und einem Kohlenhydrat- aktiven Enzym ummantelt wurden. Derartige nanostrukturierte Biohybride können wegweisend für neue Konzepte in der Biokatalyse sein. (iv) Eine Strategie für in vivo Zelloberflächen-Codisplay von Peptid und Glykan-Epitopen wurde für P. alvei entwickelt. "Maßgeschneiderte" nanostrukturierte und selbst-assemblierende Glykoproteine zeigen Möglichkeiten für neue Konzepte zur Beeinflussung oder Kontrolle komplexer biologischer Phänomene auf. Einflüsse auf das Design von künstlichen Rezeptoren, Glykokonjugat-Vakzinen oder Wirkstoff-Verabreichungsformen sind denkbar. In Zukunft wird es interessant sein, das volle Potenzial von S-Schichtglykosylierungs-Systemen zu erforschen.