Arabinosylierte Allergene in Unkrautpollen

Es sollen verschiedene Aspekte des kürzlich entdeckten O-glykosylierten Allergens Art v 1 aus Beifußpollen untersucht werden. Thema 1: Hier soll ein dem Art v 1 homologes Glykoprotein-Allergen aus Traubenkraut (ragweed) characterisiert werden. Die Struktur des Kohlenhydratteiles soll mittels Massenspektroskopie und NMR nach Fragmentierung des Allergens mittels chemischer und enzymatischer Agentien bestimmt werden. Weiters soll die Sequenz des Gens welches dieses Allergen kodiert, ermittelt werden, um eine komplette Strukturbeschreibung zu ermöglichen. Thema 2: Die immunologischen Eigenschaften der ß-Arabinosereste auf benachbarten Hydroxyprolinen von Art v 1 und von ähnlichen Allergenen sollen genauer untersucht werden. Mittels synthetischer Glycopeptide mit verschiedenen Sequenzen, unterschiedlichem Grad an Arabinosylierung und verschiedenen Zuckerstrukturen (D- Ara, L-Ara, etc.) wollen wir das Glyko-Epitop von Art v 1 genau charakterisieren. Die synthetischen Glykopeptide sollen auch zur Gewinnung spezifischer Antiseren eingesetzt werden, welche mit natürlichem Art v 1 nicht erzielt werden, da dieses immer N-glykosylierte Verunreinigungen enthält. Die Seren werden zum Aufstöbern des Ara- Hyp Epitops auf Proteinen von Pflanzen quer durch die Systematik eingesetzt. Thema 3: Wir wollen herausfinden, wie Art v 1 glykosyliert wird, wenn es in anderen Pflanzen heterolog exprimiert wird, z.B. in Tabak, einem Nachtschattengewächs, oder Salat, der auch, so wie Beifuss und Traubenkraut, zu den Korbblütlern gehört. Diese Experimente sollen nicht zuletzt dazu dienen, ein geeignetes Produktionssystem für Art v 1 für diagnostische Zwecke zu finden. Für solche Arbeiten haben wir soeben eine Mikro-Analysenmethode für Pflanzen O-Glykane entwickelt. Thema 4: Hier soll die allergologische Bedeutung des ß-Ara-Hyp Epitops bestimmt werden. Seren von Allergikern, die hauptsächlich mit dem Kohlenhydrat von Art v 1 reagieren, werden auf Ihre Reaktion mit den verschiedenen synthetischen Glykopeptiden geprüft, um die Struktur des IgE-Epitops aufzuklären., also z.B. die für Antikörper- Bindung minimal erforderliche Zahl der aufeinanderfolgenden Ara-Hyp Gruppen. "Physiologische" Tests wie die Granulocyten-Degranulation und die Bestimmung der Bindungsaffinität mittels "surface plasmon resonance" sollen Hinweise auf die klinische Bedeutung von anti-O-Glycan IgE bei Allergikern geben. Thema 5: Schlussendlich wollen wir die biochemischen Grundlagen der Protein-Arabinosylierung erhellen. Ausgehend vom Versuch, die Arabinosyltransferase-Aktivität in verschiedenen Pflanzen nachzuweisen, werden wir darangehen, das verantwortliche Enzym zu reinigen mit dem Ziel, Sequenzinformation ermitteln zu können, welche es erlaubt, das Enzym zu klonieren. Realistischerweise sei gesagt, dass schon alleine die Charakterisierung irgendeiner an der Proteinglykosylierung beteiligten Arabinosyltransferase einen beachtlichen Erfolg darstellen würde.

Traubenkraut, besser bekannt unter seinem englischem Namen "Ragweed", ist eine Unkrautpflanze, deren Pollen in Mitteleuropa eine Bedeutung als Allergen aufweisen. Im genannten Projekt untersuchten wir ein bis dato unbekanntes Allergenmolekül, welches für die Allergiediagnostik und auch Therapie von Bedeutung sein könnte. Das neue Allergen wurde - nach dem Namen der Pflanze Ambrosia artemisiifolia - Amb a 4 genannt. Amb a 4 ist ein kleines Protein, das aber aus drei Teilen besteht. Der Eine ist ein etwa kugelförmiges Protein, das im Wesentlichen für das allergene Potential von Amb a 4 verantwortlich ist. Das Zweite ist eine gestreckte Proteinkette, welche die dritte Komponente trägt, nämlich Zuckerketten. Um all diese Teile chemisch charakterisieren zu können, wurde natürliches Amb a 4 aus Ragweed-Pollen gereinigt. Mithilfe von Spezialisten für eine bestimmte physikalische Analysenmethode gelang es, die Struktur der Zuckerketten auf Amb a 4 zu bestimmen. Ragweed ist nahe verwandt mit dem Beifuß (Mugwort), dessen Hauptallergen ein dem Amb a 4 nahe verwandtes Protein ist. Die Kohlenhydrat-Anteile beider Allergene unterscheiden sich allerdings, was für die differentielle Diagnose von Ragweed und Beifuß Allergie von Bedeutung werden könnte. Die Aufgabe, das für Amb a 4 codierende Gen zu identifizieren und zu klonieren, stellte sich als ganz besonders schwierig heraus und gelang erst nach Zuhilfenahme spezieller instrumenteller Analysentechniken (Massenspektrometrie).Etwa ein Dutzend Isoformen von Amb a 4 wurden auf der genetischen Ebene gefunden. Eine davon wurde rekombinant (= künstlich im Labor) mit Bakterien hergestellt und dieses künstliche Amb a 4 wurde eingesetzt um seine Rolle als Allergen abzuschätzen. Die Seren von 30 % von Unkrautpollen-allergischen Patienten reagierten im Labortest mit unserem Amb a 4, was zeigt, das es sich um ein durchaus wichtiges Allergen handelt. Arabinosen sind häufige Bestandteile von Proteinen in Pflanzen, aber über die Enzyme, welche sie anheften ist nichts bekannt. Wir verwendeten beträchtliche Energie, um solche Arabinosyl-Transferasen in Pflanzen nachzuweisen - allerdings erfolglos. Um der Sache auf den Grund zu gehen, entwickelten wir ein neues, sehr empfindliches und spezifisches instrumentelles Verfahren, um jene Substanz in Pflanzenproben zu detektieren, die - vermutlich - das Substrat für die Protein-Arabinosylierung darstellt.