Ultrastruktur endosomaler Signalübertragung

Zellen kommunizieren mit ihrer Umgebung, indem sie Signale an der Oberfläche wahrnehmen, nach innen leiten, verarbeiten und durch eine biologische Reaktion beantworten. Die Signale werden stufenweise, d.h. in Kaskaden, weitergeleitet und verstärkt. Um dadurch eine spezifische biologische Antwort hervorzurufen, müssen diese Signalkaskaden innerhalb der Zelle örtlich und zeitlich genau reguliert ablaufen. Dabei spielen Gerüst- Eiweißkörper (Scaffolds) eine entscheidende Rolle, da sie Signalkomplexe an bestimmten Membranen in der Zelle zusammenführen. Diese Membranen können wiederum unterschiedlich organisiert sein, sodass sich die Signalweiterleitung nur innerhalb bestimmter Bezirke (Domänen) abspielt. Solche Domänen werden durch verschiedene Eiweißkörper und Fette gebildet. Wie diese Signalübertragung in solchen Domänen geregelt wird, wie diese Domänen aussehen, und welcher Dynamik sie unterliegen, ist Ziel der hier vorgestellten Untersuchungen. Dazu werden wir modernste mikroskopische Methoden einsetzen. Zum Beispiel ermöglicht Hochdruck- Gefrierfixierung die subzellulären Strukturen und Prozesse innerhalb von Tausendstel Sekunden im wahrsten Sinn des Wortes "einzufrieren", und damit für Hochauflösungs-Elektronenmikroskopie zugänglich zu machen. Die so gewonnenen Momentaufnahmen spiegeln die dynamischen Verhältnisse in der lebenden Zelle höchst wirklichkeitsgetreu wider. Diese Art der Präparation erlaubt in Verbindung mit spezifischen Antikörper- Nachweistechniken die sehr präzise Zuordnung der untersuchten Eiweißkörper zu bestimmten subzellulären Bauelementen (wie Membranen oder Elementen des Zellskelettes). Wir werden mit Hilfe modernster genetischer und molekular biologischer Methoden in Kombination mit hochauflösenden Abbildungsverfahren eine detaillierte "sub-zelluläre Aktivitäts-Landkarte" einer höchst wichtigen Signalkaskade erstellen. Solch eine Landkarte könnte als Referenz für normale Signalübertragung in gesunden Zellen dienen. Überdies könnte sie auch neues Licht auf gestörte Signalübertragungsprozesse werfen, wie sie zum Beispiel bei Krebserkrankungen auftreten.

Voraussetzung für die Kommunikation von Zellen mit ihrer Umgebung ist die Wahrnehmung von extrazellulären Signalen mit Hilfe spezifischer Oberflächenrezeptoren. Die aufgenommenen Signale werden stufenweise, d.h. in Kaskaden, im Zellinnneren weitergeleitet, verstärkt und verarbeitet, was schliesslich adäquate biologischer Reaktionen auslöst. Ein wichtiger Vertreter der Rezeptoren für Wachstumsfaktoren ist der sog. EGF-Rezeptor (Abkürzung für engl. Epidermal-Growth-Factor-Receptor), der das normale Wachstum und die geordnete Differenzierung der Zellen im Gewebeverband steuert. In verschiedenen Tumorarten wird der EGFR hochreguliert bzw. tritt in mutierter Form auf, was unkontrolliertes Wachstum, sowie Vermehrung und Migration der Tumorzellen nach sich zieht. Aktivierung des EGFR an der Zelloberfläche führt nicht nur unmittelbar zur Nachrichtenübermittlung sondern auch zur Aufnahme des aktiven Rezeptors mittels spezifischer Membranbläschen (oder Membranvesikel) in das Zellinnere. Diese sich dynamisch verändernden Membranvesikel, sogenannte "Endosomen" wurden durch die Arbeiten verschiedener Forschungsgruppen in den letzten Jahren zunehmend als Schlüsselspieler in der Steuerung und Effizienzsteigerung von intrazellullärer Signalübertragung erkannt. Unser Interesse gilt den verschiedenen in vivo Funktionen eines intrazellullären Signal-Moduls, bestehend aus dem Adaptorproteins p14 und seinen Interaktionspartnern, das innerhalb streng definierter Bezirke (Domänen) solcher endosomaler Membranvesikel auftritt. Wir konnten zeigen, daß p14-enthaltende Endosomen für die räumliche und zeitliche Feinabstimmung solcher Signalkaskaden erforderlich sind, so zum Beispiel für den geordneten Ablauf des Zellzyklus. Überdies fanden wir, daß die korrekte Positionierung dieser, auch als "signalisierende Endosomen" bezeichneten Membranvesikel innerhalb der Zelle unerläßlich für die Qualität und die richtige Dauer der Nachrichtenübertragung ist. Weiters haben wir uns die einfache, jedoch noch immer nur teilweise beantwortete Frage gestellt, was eigentlich "signalisierende Endosomen" auszeichnet. Wir haben daher diese wichtigen und sehr diversen Zellkompartimente bezüglich ihrer sich dynamisch verändernden Feinstruktur und biochemischen Eigenschaften im Detail analysiert. Ziel war die Erstellung einer "subzellulären Aktivitäts-Landkarte" einer höchst wichtigen Signalkaskade mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Dazu bedienten wir uns genetisch veränderter Maus-Zellkulturen, denen z.B. das Adaptorprotein p14 oder einer seiner wichtigsten Interaktionspartner (MEK1) fehlt, und etablierten optimierte hochauflösende Mikroskopietechniken und Antikörper- Nachweismethoden für die dafür nötigen, komplexen Versuchsanordnungen. Moderne Kryo-Präparation erlaubte uns, zelluläre Strukturen und Prozesse innerhalb von Tausendstel Sekunden im wahrsten Sinn des Wortes "einzufrieren", und damit in bester Qualität für die Elektronenmikroskopie zugänglich zu machen. Die so gewonnenen Momentaufnahmen spiegeln die dynamischen Verhältnisse in der lebenden Zelle höchst wirklichkeitsgetreu wider und werden sehr effizient durch Hochauflösungs-Echtzeit-Video-Lichtmikroskopie ergänzt. In Verbindung mit spezifischen Antikörper-Nachweistechniken war auch die sehr präzise Zuordnung der untersuchten Eiweißmoleküle zu bestimmten subzellulären Bauelementen wie Membranen oder Elementen des Zellskelettes möglich.