Toxin-Antitoxin-DNA Wechselwirkungen

Plasmide treten häufig in sehr geringer Zahl auf und benutzen Toxin-Antitoxin (TA) Systeme um deren Überleben in einer Bakterienkolonie zu sichern. Dies geschieht durch das Abtöten von Bakterien welche nicht das Plasmid während der Zellteilung vererbt bekamen. TA Systeme wurde auch auf bakteriellen Chromosomen gefunden. Obwohl die Funktion chromosomaler TA Systeme noch immer heftig diskutiert wird, wurde postuliert das diese ihren Wirtsbakterien bei Nahrungsmangel helfen und zwar durch die Beeinflussung der Protein und DNA Synthese durch Verminderung der Translation und Replikation. Im vorgeschlagenen Projekt beabsichtigen wir strukturelle und dynamische Untersuchungen des chromosomalen Antitoxins MazE gebunden an seine DNA. Dieser Protein- DNA Komplex wird der erste dieses "folds" sein, da eine komplett neue DNA-bindende Struktur in der N- terminalen Domäne von MazE gefunden wurde. Zusätzlich werden wir die ternären Wechselwirkungen von Toxin (CcdB), Antitoxin (CcdA) an deren DNA mit einer neuen Austausch-unterdrückten NMR Methode untersuchen. Ein neuartiger Ansatz wird auch etabliert und benutzt zur Bestimmung der Struktur des MazE-DNA Komplexes in Lösung. Dazu werden wir paramagnetische Relaxationsratenerhöhungen (PRE) als strukturelevante Informationen heranziehen. Durch diese PRE Werte kann die Anzahl der notwendigen NOEs zur Strukturbestimmung deutlich reduziert werden Neben der Etablierung dieser neuen Techniken wird das Projekt zu einem tieferen Verständnis der Plasmid- stabilisierung- und vererbung beitragen, sowie Informationen liefern über mögliche Unterschiede zwischen plamidischen und chromosomalen Toxin-Antitoxin Systemen. Neben diesen fundamentalen biologischen Fragen spielen TA Systeme auch eine immer wichtiger werdende Rolle in der Biotechnologie wegen deren Einsatz zur Stabilisierung von Vektoren in rekombinanten Systemen. Weiters können strukturelle Untersuchungen an TA Systemen auch wichtige Informationen liefern für das Design neuer Antibiotika oder einen neuen Weg zur Bekämpfung von Antibiotikaresistenzen eröffnen. Letztere benutzen TA Systeme um deren Überleben während der Zellteilung sicher zu stellen.

Die Hauptziele des Projektes konnten vollständig erreicht bzw. teilwiese übertroffen werden: Die Methode zur Benutzung paramagnetischer Relaxationsratenerhöhungen zur Strukturbestimmung von Proteinen wurde an Ubiquitin und Maltose-bindendem Protein gezeigt und publiziert im renommierten Journal Angewandte Chemie Int.Ed (T.Madl, W.Bermel and K.Zangger, Use of relaxation enhancements in a paramagnetic environment for the structure determination of proteins using NMR spectroscopy, Angew.Chem.Int.Ed.48(44), 8259-8262, 2009). Diese Methode wird derzeit von uns und auch einigen anderen Gruppen bereits erfolgreich zur Strukturbestimmung von Proteinen mittels NMR eingesetzt. Ein Manuskript über die Anwendung dieser Technik zur Struktur eines kleinen Proteins sowie dessen transiente DNA-Bindung ist derzeit in Vorbereitung. Weiters wurde das Toxin CcdB zuerst mittels NMR Spektroskopie zugeordnet und dann dessen Struktur gleichzeitig in Lösung mittels NMR, sowie auch im Kristall von unserem Kollaborator Remy Loris an der Universität Brüssel. Die Strukturen wurden zusammen im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht (N. De Jonge, W.Hohlweg, A. Garcia-Pino, M. Respondek, L. Buts, S. Haesaerts, J. Lah, K. Zangger and R. Loris, Structural and thermodynamic characterization of Vibrio fischeri CcdB, J.Biol.Chem. 285(8), 5606-5613, 2010). Zusammen mit derselben Gruppe untersuchten wir auch die Regeneration von CcdB inhibierter Gyrase durch die Bindung eines von CcdA-abgeleiteten Peptides (N. de Jonge, A. Garcia-Pino, L. buts, S. Haesaerts, D. Charlier, K. Zangger, L. Wyns, H. De Greve and R. Loris, Rejuvenation of CcdB-poisened gyrase by an intrinsically disordered protein domain., Mol. Cell, 35, 154-163 2009). Zusätzlich bestimmten wir die Struktur des bakteriellen Antitoxins MazE sowie dessen Komplex mit DNA. Derzeit wird eine Publikation dazu vorbereitet, welche in den nächsten Monaten zur Publikation eingereicht werden wird.