Mrs2p: Struktur/Funktionsanalyse

Mg2+ Transportproteine eukaryontischer (Mrs2, Alr1) und bakterieller Zellen (CorA) bilden eine große, diverse Proteinfamilie. Während andere Labors jüngst die CorA 3-D Struktur erstellt haben, haben wir Mrs2+ funktionell (als Mg2+-Ionenkanal) charakterisiert. Hier wollen wir nun vergleichende Struktur/Funktions-Studien an Mrs2 und CorA durchführen. Dies soll in Kooperation von drei Labors mittels Röntgenstrukturanalyse, Elektrophysiologie und Genetik erfolgen. Die besondere Chemie des Mg2+ Ions und die einzigartige Struktur der CorA-Mrs2-Alr1 Familie lassen neue Einblicke in die Funktion und Regulation eines Ionenkanals und dessen physiologischer Bedeutung für die Zelle erwarten.

Physiologische Untersuchungen von mehreren Jahrzehnten beschrieben verschiedene Transport-Aktivitäten für Ionen über die mitochondriale Innenmembran. Kationen wie K + , Na+ , Ca2+ oder Mg 2+ werden durch elektrophoretische Prozesse aufgenommen, die das hohe negative Membranpotential innerhalb der Mitochondrien als treibende Kraft benützen. Ein genetischer Screen in der Hefe Saccharomyces cerevisiae führte zur Identifizierung von MRS2, welches als Protein für die Mg 2+-Aufnahme in Mitochondrien dient. Es ist ein Homolog des Bakterien CorA Mg 2+ Transportproteins und des Hefeplasmamembran Mg 2+ Transportproteins ALR1. Das Säugetier Genome exprimiert ein funktionelles Ortholog yMrs2p in ihren Mitochondrien, das Pilzgenomen zwei Orthologe (Mrs2p und Lpe10p in Hefe). Die Mitglieder des Cora-Mrs2-ALR1 Superfamilie scheinen also die bestimmende Klasse von Mg 2+ Transportproteinen in Bakterien, Pflanzen und niederen Eukaryonten zu repräsentieren, während Säugetiere nur ein einziges Mitglied der Mrs2 Familie in ihren Mitochondrien aufweisen. Alle Mitglieder der Cora-Mrs2-ALR1 Protein-Superfamilie besitzen zwei benachbarte Transmembrandomänen (TM-A,-B TM) in der Nähe ihres C-Terminus. TM-A endet mit einem F / Y-G-M-N-Motiv. Das Hefe Mrs2 Protein exponiert sowohl die lange N-terminale als auch die kürzere C-terminale Sequenz ins Innere der mitochondrialen Matrix. Nur die kurze Sequenz, die die beiden TM-Domänen verbindet, liegt erscheint auf der Außenseite der inneren Mitochondrienmembran (Intermembranraum). Dieses Projekt, das einen strukturellen und physiologischen Ansatz kombiniert, zielt darauf ab, ein detailliertes Bild von dieser einzigartigen Familie von Kanal-Proteinen und dem Mechanismus ihrer Mg 2+ Leitfähigkeit an Hand von CorA und Mrs2 Proteinen zu entwickeln. Als erstes charakterisiertes Kanal-Protein der inneren Mitochondrienmembran, sollen Mrs2 Proteine als Modell für die Ionen-Aufnahme in diese Organellen und etwaigen patho-pyhsiologischen Auswirkungen dienen. Unsere Untersuchungen stellen das erste molekulare Bild der regulatorischen N-terminalen Domäne des eukaryotischen Magnesium-Transporter Mrs2 aus S. cerevisiae dar. Zusammen mit Struktur-basierter Mutagenese und der funktionellen Analyse in vivo, erhielten wir Einblick in Gating und Regulierung des Mrs2 Mg 2+ Transports. Wir identifizierten Aminosäuren, die essentiell für die Bindung zweiwertiger Kation sind, sowie weitere die eine Bedeutung für die Bildung eines hydrophoben Gate besitzen und zeigten, dass die gesamte C- terminale Region eine Engstelle ausbilden kann. Die hoch konservierte GMN Motiv des Cora-Mrs2-ALR1 Familie von Mg 2+ Transportern wurde als eine unerlässliche Voraussetzung für den Mg 2+ Transport bestätigt. Wir führten Zufallsmutagenese des GMN Motiv von Saccharomyces cerevisiae Mrs2p in einem genetischen Screen durch. Wir erhielten eine große Anzahl von Mutanten, die noch in der Lage sind, Mg 2+ Transport zu gestatten, wenn auch nicht mit der Effizienz des wildtyp- Kanals, wie durch Messungen des Mg 2+-Einstroms in isolierten Mitochondrien gezeigt werden konnte. Ferner haben wir systematisch das konservierte hydrophobe Gate des Magnesium-Transporter CorA und bestätigten die Bedeutung des Leu294 für das Gating. Darüber konnten wir zeigen, dass das Mrs2 Homolog Lpe10p die Aktivität des Mrs2p-basierten Hefe mitochondrialen Mg 2+-Kanal modulieren kann, während dem Lpe101 Protein selbst eine Transportfunktion in Abwesenheit von Mrs2p fehlt. Summa summarum gelang es uns in diesem Projekt ein detailliertes molekulares Bild von Mg 2+ Transport Systemen zu entwickeln, und ein molekulares Verständnis derer Pemeationseigenschaften sowie von regulatorischen Gating Prozessen zu liefern.