Rekombinante humane Lakto- und Eosinophile Peroxidase

Im menschlichen Köper gibt es verschiedene Häm-Peroxidasen, die in der unspezifischen Immunabwehr eine wichtige Rolle spielen. Laktoperoxidase (LPO) findet man beispielsweise in der Muttermilch, im Speichel und in der Tränenflüssigkeit. Eosinophile Peroxidase (EPO) kommt in speziellen weißen Blutzellen, den sog. Eosinophilen, in hoher Konzentration vor und wird bei Befall des menschlichen Körpers mit Parasiten ausgeschüttet. Beide Enzyme produzieren durch Oxidation von Halogeniden und Thiocyanat antimikrobiell wirkende Oxidationsmittel. Auf der anderen Seite wird spekuliert, dass beide Proteine an der Entstehung von Krankheiten beteiligt sind. Laktoperoxidase beispielsweise soll durch Oxidation von Arzneimitteln oder körperfremden Stoffen an der Entstehung von Brustkrebs beteiligt sein, während EPO eine wichtige Rolle bei allergischen und chronischen Atemwegserkrankungen (z.B. Asthma) zu spielen scheint. Vor allem aufgrund des beschränkten Zugangs zu natürlichen Quellen und die schwierige Reinigung, sind allerdings sowohl die funktionalen als auch strukturellen Eigenschaften von beiden humanen Enzymen weitgehend unbekannt. Basierend auf unserer Erfahrung in der Expression verwandter Proteine in produzierenden Säugetierzelllinien, ist uns kürzlich die gentechnische Herstellung von (rekombinanter) humaner Laktoperoxidase gelungen. Erste Versuche in der Produktion rekombinanter humaner EPO sind ebenfalls vielversprechend. Nach Optimierung der Produktion und Evaluierung alternativer Klonierungsstrategien und Produktionszelllinien sollen beide Oxidoreduktasen in hoher Ausbeute produziert werden. Mit Hilfe dieser Modellprotein können dann erstmals umfangreiche Struktur- Funktionsbeziehungen durch eine Kombination von molekularbiologischen, biochemischen und biophysikalischen Methoden durchgeführt werden. Mit Hilfe der UV-Vis und Resonanz-Ramanspektroskopie werden Hämstruktur- und Umgebung, sowie Oxidations- und Spinzustand des Hämeisens untersucht. Spektroelektrochemische Untersuchen werden Rückschlüsse auf die Reduktionspotentiale relevanter Redoxpaare erlauben. Mittels Multimixing-Stopped-flow-Spektroskopie in Kombination mit Mutagenese sollen schließlich die Mechanismen der Liganden bzw. Substratbindung im aktiven Zentrum als auch sämtliche Redox-Teilreaktionen des Halogenid- und Peroxidasezyklus aufgeklärt werden. Parallel wird versucht beide Proteine zu kristallisieren und ihre Struktur mittels Röntgenbeugung aufzuklären. Die Untersuchungen werden in Zusammenarbeit mit drei renommierten Gruppen in Italien und Spanien durchgeführt. Diese Forschungen sind nicht nur die notwendige Basis für das Verständnis der physiologischen und pathophysiologischen Rolle(n) von LPO und EPO, sondern auch für die zukünftige rationale Entwicklung von spezifischen Pharmazeutika.

Im menschlichen Körper gibt es verschiedene Häm-Peroxidasen, die in der unspezifischen Immunabwehr eine wichtige Rolle spielen. Laktoperoxidase (LPO) findet man beispielsweise in der Muttermilch, im Speichel und in der Tränenflüssigkeit. Eosinophile Peroxidase (EPO) kommt in speziellen weißen Blutzellen, den sog. Eosinophilen, in hoher Konzentration vor und wird bei Befall des menschlichen Körpers mit Parasiten ausgeschüttet. Beide Enzyme produzieren durch Oxidation von Halogeniden und Thiocyanat antimikrobiell wirkende Oxidationsmittel. Auf der anderen Seite wird spekuliert, dass beide Proteine an der Entstehung von Krankheiten beteiligt sind. Laktoperoxidase beispielsweise soll durch Oxidation von Arzneimitteln oder körperfremden Stoffen an der Entstehung von Brustkrebs beteiligt sein, während EPO eine wichtige Rolle bei allergischen und chronischen Atemwegserkrankungen (z.B. Asthma) zu spielen scheint. Vor allem aufgrund des beschränkten Zugangs zu natürlichen Quellen und die schwierige Reinigung, sind allerdings sowohl die funktionalen als auch strukturellen Eigenschaften von beiden humanen Enzymen weitgehend unbekannt. Basierend auf unserer Erfahrung in der Expression verwandter Proteine in produzierenden Säugetierzelllinien, ist uns kürzlich die gentechnische Herstellung von (rekombinanter) humaner Laktoperoxidase gelungen. Erste Versuche in der Produktion rekombinanter humaner EPO sind ebenfalls vielversprechend. Nach Optimierung der Produktion und Evaluierung alternativer Klonierungsstrategien und Produktionszelllinien sollen beide Oxidoreduktasen in hoher Ausbeute produziert werden. Mit Hilfe dieser Modellprotein können dann erstmals umfangreiche Struktur- Funktionsbeziehungen durch eine Kombination von molekularbiologischen, biochemischen und biophysikalischen Methoden durchgeführt werden. Mit Hilfe der UV-Vis und Resonanz-Ramanspektroskopie werden Hämstruktur- und Umgebung, sowie Oxidations- und Spinzustand des Hämeisens untersucht. Spektroelektrochemische Untersuchen werden Rückschlüsse auf die Reduktionspotentiale relevanter Redoxpaare erlauben. Mittels Multimixing-Stopped-flow-Spektroskopie in Kombination mit Mutagenese sollen schließlich die Mechanismen der Liganden bzw. Substratbindung im aktiven Zentrum als auch sämtliche Redox-Teilreaktionen des Halogenid- und Peroxidasezyklus aufgeklärt werden. Parallel wird versucht beide Proteine zu kristallisieren und ihre Struktur mittels Röntgenbeugung aufzuklären. Die Untersuchungen werden in Zusammenarbeit mit drei renommierten Gruppen in Italien und Spanien durchgeführt. Diese Forschungen sind nicht nur die notwendige Basis für das Verständnis der physiologischen und pathophysiologischen Rolle(n) von LPO und EPO, sondern auch für die zukünftige rationale Entwicklung von spezifischen Pharmazeutika.