Genetische Analyse von RNA-vermittelter DNA Methylierung

RNA-vermittelte DNA-Methylierung (RvDM) trägt substantiell zur epigenetischen Regulation des Pflanzengenoms bei. Methylierung wird veranlasst durch homologe DNA Zielsequenzen mittels 24 Nukleotide langen "heterochromatischen" kleinen RNA Molekülen, die von den im Zellkern lokalisierten Komponenten der RNA- Interferenz (RNAi) Maschinerie und einer Pflanzen-spezifischen RNA Polymerase, die als PolIV bezeichnet wurde, erzeugt werden. Obwohl die exakten Funktionen von RvDM in Pflanzen nicht völlig verstanden sind, wurde vorgeschlagen, dass sie bei der Stilllegung von Transposons, als auch für die Entwicklung und Stress Adaptierung von Pflanzen eine Rolle spielt. Wir haben bereits einige Schlüsselkomponenten der RvDM Maschinerie in zwei genetischen "Screens" identifizieren können, die auf speziell konstruierten Transgen-Inaktivierungs-Systemen in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana beruhen. In diesen Inaktivierungs-Systemen werden Promotoren, die die Expression von leicht beobachtbaren Reporter-Genen steuern, gezielt durch Erzeugung von kleinen RNA Molekülen methyliert, und damit inaktiviert. Für das zur Zeit bearbeitete System verwenden wir eine Enhancer Region, die in Meristemen (Stammzellen in denen entwicklungsbiologische Entscheidungen stattfinden) aktiv ist, um damit ein hochsensitives Zwei-Komponentensystem aufzubauen, welches uns eine genetische Analyse von RvDM, die Erzeugung von sekundären kleinen RNA Molekülen, und Ausweitung von DNA Methylierung über den unmittelbaren homologen Bereich hinaus in einem Entwicklungsbiologischen Zusammenhang erlaubt. Wir haben bereits die Nützlichkeit dieses Systems bewiesen durch Identifizierung einer neuen Komponente der RvDM Maschinerie, die wir als DMS3 bezeichnet haben, in unserem neuen genetischen "Screen". DMS3 ist ein structural maintenance of chromosomes hinge domain-containing protein`. Durch unseren "Screen" wird diese Protein erstmals und zwingend in den Zusammenhang mit RNA vermittelter Chromatin Modifikation gebract. Ein verwandtes Protein in Mäusen, Smchd1, wurde von Blewitt, Whitelaw und MitarbeiternInnen vor kurzem bei einem anderen epigenetischen Phänomen (X chromosome inactivation`), welches regulatorische Ribonukleinsäuren (XistRNA) und Ausweitung von DNA Methylierung betrifft, gefunden. In der vorgeschlagenen Arbeit planen wir die Identifizierung und Charakterisierung von weiteren Mutanten dieses oben beschriebenen neuen vorwärts genetischen "Screen", als auch die Bestimmung der Rolle der identifizierten Genprodukte in der Regulation von Transkription und genomischen Methylierungsmustern in Arabidopsis, und Beginn der Analyse ihrer Art zu agieren. Die Resultate werden wichtig für das Verstehen von wie inaktive epigenetische Stadien vermittelt über kleine RNA Moleküle entstehen, und wie sie sich danach über ganze chromosomale Abschnitte ausweiten können; diese Resultate sollten sowohl relevant für Pflanzen als auch Säugetiere sein.

Wir verwendeten einen genetischen Weg für die Entdeckung von neuen Faktoren, die für einen wichtigen epigenetischen Vorgang in Pflanzen nötig sind, der die Weiterverbreitung von chromosomalen oder genomischen Parasiten, den sogenannten Transposons begrenzt. Ohne dieses System können sich Transposons im Genom ungehindert ausbreiten, und in neue Stellen von Chromosomen integrieren und dabei die Vollständigkeit der pflanzlichen DNA zerstören. Dieser wichtige epigenetische Prozess, der hilft die Aktivität der Transposons einzuschränken, wird als RNA-dirigierte DNA Methylierung (RdDM) bezeichnet. RdDM gibt Pflanzen ein sehr spezifisches Mittel, über kurze sogenannte "leitende" RNAs, gezielt die Inaktivierung von Transposons durch eine chemische Modifizierung (Cytosin Methylierung) der Transposons eigenen DNA zu bewirken. Obwohl RdDM ein wichtiger Abwehrmechanismus des Genoms in Pflanzen ist, war bis vor kurzem nur sehr wenig über die, für die Ermöglichung der einzelnen Schritte in diesem Weg nötigen Proteine, bekannt. Ein genetischer Screen, den wir für Arabidopsis Pflanzen dafür entwickelten, Mutanten, die in RdDM defekt sind, finden zu können, erlaubte uns über 12 Faktoren, die für RdDM nötig sind zu identifizieren. Viele dieser Faktoren sind pflanzenspezifisch und waren funktional uncharakterisiert bevor wir sie RdDM zuordnen konnten. Unsere Resultate haben daher in signifikanter Weise zur Identifikation von neuen Bestandteilen der RdDM Maschienerie bei-getragen, und die Grundlage geschaffen für eine detailierte Analyse des Mechanismus von RdDM. Es ist möglich, dass unsere Resultate eventuell von wichtiger Bedeutung für die Agrobiotechnologie sein werden, durch Aufzeigen von Möglichkeiten, wie diese Fähigkeit von Pflanzen die Aktivität von Transposons zu beschränken, verbessert werden könnte, oder wie sie für die selektive Kontrolle von Pflanzengenaktivitäten verwendet werden könnte.