Molekulare und funktionelle Analyse von Pctk1

Pctk1 ist eine Serin/Threonin Kinase, die zur Familie der Cyclin-abhängigen Kinasen (CDK) gehört. CDKs sind v.a. wegen ihrer Funktion in der Regulation der Zellteilung bekannt. CDKs bestehen aus einer katalytischen und einer regulatorischen Untereinheit, dem Cyclin. Im Gegensatz zu den besser verstandenen, die Zellteilung regulierenden, CDKs, ist die Funktion und Regulation von Pctk1 immer noch unklar. Das liegt unter anderen daran, dass weder eine aktivierende Untereinheit, noch ein eindeutiges Substrat bisher identifiziert werden konnten. Um zu untersuchen, ob es sich bei dieser Kinase um ein essentielles Protein handelt, wurde das Gen durch konditionale Gendeletion aus dem Genom eines Mausstammes entfernt. Die Pctk1 defizienten Tiere entwickeln sich weitgehend normal, doch sind die Männchen infertil, da die Spermien einen Entwicklungsdefekt aufweisen und unbeweglich sind. Diese genetische Analyse zeigt also, das Pctk1 essentiell ist und für die Spermatogenese benötigt wird. Wir wollen in diesem Projekt diese Erkenntnisse nun verwenden, um einerseits mehr über die Rolle von Pctk1 in der Spermatogenese zu lernen, als auch nach Pctk1 Aktivatoren und Substraten in den Spermatiden zu suchen. Unsere vorläufigen Untersuchungen zeigten, dass Pctk1 für die letzten Schritte der Spermatogenese, also der Ausbildung funktioneller und beweglicher Spermien, benötigt wird. Störungen dieses letzten Schrittes der Spermienbildung findet man auch bei infertilen Männern, und eine Entschlüsselung der Funktion von Pctk1 könnte daher wichtige Erkenntnisse zur Diagnostik und ev. Therapie der Infertilität liefern. Durch die Identifizierung von Proteinen, welche mit Pctk1 interagieren können, soll einerseits der Regulationsmodus dieser Kinase etabliert, andererseits durch Definition von Substraten die biochemische Funktionsweise dieses Proteins erarbeitet werden. Pctk1 ist als Kinase ein prinzipiell durch kleine Moleküle inhibierbares Molekül. Da Verlust der Funktion von Pctk1 nur die terminalen Schritte der Spermatogenese betrifft, könnten Pctk1 Inhibitoren aber auch als Verhütungsmittel für den Mann in Betracht gezogen werden.

Die PCTAIRE Protein Kinasen (PCTK) gehören zur Familie der cyclin-abhängigen Kinasen (CDK). Zu dieser Familie gehören 26 Proteine, die essentiell an der Zellteilung sowie an zahlreichen anderen zellulären Vorgängen beteiligt sind. Die PCTAIRE-Kinasen 1, 2, und 3 werden auch als CDK16, 17 und 18 bezeichnet und sind wenig charakterisiert. In dieser Studie haben wir den Aktivierungsmechanismus, die Regulation sowie die Funktion von PCTK1/CDK16 erforscht. CDK16 wird vor allem in Neuronen und in Zellen des Hodens exprimiert, findet sich jedoch auch in zahlreichen Tumorzellinien. Um einen möglichen Aktivator für PCTK16 zu identifizieren, wurde ein Hefe-2-Hybrid-Interaktions-Screen durchgeführt, mit welchem Cyclin Y (CCNY) als CDK16 interagierendes Protein identifiziert werden konnte. CCNY, ein myristoyliertes membrangebundenes atypisches Cyclin, bindet an CDK16 und aktiviert dessen Kinaseeigenschaften. Genauere Untersuchung der Interaktion zwischen diesen beiden Proteinen zeigte, dass, im Gegensatz zu anderen CDKs, die katalytische Domäne von CDK16 für die Bindung von CCNY nicht ausreicht, da auch Domänen in der N-terminalen Extension von CDK16 benötigt werden. Die Bindung von CCNY an CDK16 ist weiters durch den Phosphorylierungszustand von Serin 119 und Serin 153 in diesen Domänen reguliert, die gemeinsam eine Bindungsstelle für 14-3-3 Regulatorproteine bilden. Koexpression von CCNY und CDK16 in Insektenzellen bestätigte Kinaseaktivierung von CDK16 durch CCNY. Die gereinigte rekombinante Kinase konnte für in vitro Experimente verwendet werden, die zur Identifikation einer neuen Phosphorylierungskonsensussequenz führte. Um die Funktion von CDK16 charakterisieren zu können wurde ein Mausstamm generiert, in welchen die Kinasedomäne von PCTK1(CDK16 durch Cre Rekombinase deletiert werden kann. Die CDK16 defizienten Mäuse zeigten keine auffälligen entwicklungsbiologischen Defekte und entwickelten sich normal. CDK16 defiziente Männchen waren jedoch aufgrund eines Spermatogenesedefektes infertil. Analyse der Spermatogenese zeigte einen Defekt in der terminalen Differenzierung, die zu einer Abknickung und Immotilität der Spermien, also Asthenozoospermie, führte. Wir untersuchten daraufhin eine Kohorte von 500 Männern mit Asthenozoospermie und fanden, eine neue Mutation im CDK16/PCTK1 Gen, dessen Bedeutung für die Funktion des Enzyms jedoch erst charakterisiert werden muss. Weiters haben wir Sequenzvergleiche zwischen CDK16 und CCNY verwandten Genen in Eukaryonten durchgeführt und gefunden, dass CDK16 und CCNY nur in Tieren, nicht aber in Einzellern und Pflanzen zu finden sind, was auf eine Koevolution dieser Kinasen mit einem Nervensystem hinweist.Zusammengefasst konnten wir zeigen dass CDK16 für die Spermatogenese essentiell ist, von einem membranständigen Cyclin aktiviert wird, dessen Bindung durch Phosphorylierung von CDK16 reguliert wird und ein neues Substratspektrum zeigt.