Zielgene des MDS-assoziierten Transkriptionsfaktors EVI 1

Myelodysplastische Syndrome (MDS) stellen eine Gruppe von klonalen malignen Erkrankungen myeloischer Zellen dar, die sich durch Hyperzellularität und Dysplasie des Knochenmarks bei gleichzeitiger Zytopenie (Zellarmut) des peripheren Bluts auszeichnen. Derzeit verfügbare Therapien sind in den seltensten Fällen kurativ; die Patienten versterben entweder an den Folgen der Zytopenie, oder weil sich die Krankheit in eine therapieresistente Form der akuten myeloischen Leukämie (AML) weiterentwickelt. Über die genetische Basis von MDS ist vergleichsweise wenig bekannt; in einem beträchtlichen Anteil von MDS-Patienten wurde jedoch Überexpression des Onkogens EVI1 gefunden. Überexpression dieses Gens ruft auch im Mausmodell MDS hervor; zudem beeinflußt sie Teilungsrate, Differenzierung und Tod kultivierter Zellen. Verschiedene biochemische Eigenschaften des EVI1-Proteins legen nahe, daß seine biologischen Effekte vor allem auf seine Fähigkeit, die Transkription anderer Gene zu beeinflussen, zurückzuführen sind. Bisher wurden jedoch nur sehr wenige durch EVI1 regulierte Gene beschrieben. Um zu einem besseren Verständnis der Rolle von EVI1 in MDS beizutragen, sollen im Rahmen des vorgelegten Projekts weitere EVI1-Zielgene identifiziert und charakterisiert werden. Im Zuge unserer Vorarbeiten haben wir die menschliche myeloische Zelllinie U937T_EVI1-HA, in der die Expression von EVI1 durch Weglassung des Antibiotikums Tetrazyklin aus dem Kulturmedium angeschalten werden kann, etabliert und zu charakterisieren begonnen. Die Induktion von EVI1 in diesen Zellen beeinträchtigt ihre Teilungs- und Überlebensfähigkeit. Zudem verhindert sie präliminären Daten zufolge in einer für MDS typischen Weise die Zellreifung (Differenzierung): EVI1-exprimierende Zellen sterben unter Bedingungen, die in Kontrollzellen zur Differenzierung führen, ab. Insgesamt zeigen U937T_EVI1-HA Zellen also für MDS charakteristische zelluläre Verhaltensweisen. Im vorliegenden Projekt sollen die Auswirkungen der EVI1-Expression auf die Differenzierung und den Zelltod von U937T_EVI1-HA-Zellen weiter untersucht werden. Zudem sollen mithilfe von Microarray-Analysen EVI1- Zielgene identifiziert werden, und zwar sowohl unter den `traditionellen` proteinkodierenden Genen, als auch in der erst vor kurzem entdeckten Klasse der Mikro-RNA Gene. Die Regulation ausgewählter EVI1-Zielgene wird mittels quantitativer RT-PCR bestätigt, und mittels Reportergen-Assays und Chromatin-Immunpräzipitationsexperimenten näher charakterisiert werden. Außerdem soll die Bedeutung dieser Gene für die biologischen Wirkungen von EVI1 untersucht werden. Die Ergebnisse dieser Studien werden wichtige neue Einsichten in die Mechanismen vermitteln, durch die EVI1 zur Entstehung und den klinischen Eigenschaften von MDS beiträgt.

Das "ecotropic viral integration site 1" (EVI1) Gen spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen Entwicklungsprozessen, ist jedoch in den reifen Zellen der meisten Gewebe des adulten Organismus wenig bis gar nicht aktiv ("exprimiert"). Hingegen kann es in den Zellen verschiedenster Tumore aktiviert sein und einerseits zur Tumorentstehung beitragen, andererseits das Ansprechen der malignen Zellen auf chemotherapeutische Agentien negativ beeinflussen. Besonders gut ist der Zusammenhang zwischen EVI1 Überexpression und schlechtem Therapieerfolg bei der akuten myeloischen Leukämie (AML) dokumentiert, aber auch beim myelodysplastischen Syndrom (MDS), einer Vorstufe mancher AML-Erkrankungen, spielt die Aktivierung von EVI1 eine Rolle.Ziel des Projekts P20920 war es, mit Hilfe eines geeigneten Modellsystems zu einem besseren Verständnis der Funktionsweise von EVI1 im Kontext von AML und MDS beizutragen. Dazu wurde zunächst eine menschliche Zelllinie der myeloischen Reihe - also des Zelltyps, dessen pathologische Veränderung diesen beiden Erkrankungen zugrunde liegt - so manipuliert, dass sie EVI1 in steuerbarer Weise exprimierte. Dies rief eine Reihe von zellulären Verhaltensweisen hervor, die spezifische Eigenschaften von AML und MDS widerspiegelten. Die aus klinischer Sicht wichtigste davon war eine im Vergleich zu Kontrollzellen verringerte Sensitivität gegenüber chemotherapeutischen Agentien: wiewohl für das Verständnis der Rolle von EVI1 bei der AML von besonderer Bedeutung, war eine solche Therapieresistenz zuvor noch nicht in einem der experimentellen Analyse zugänglichen System beschrieben worden. Da EVI1 die Eigenschaften eines klassischen Regulators der Genaktivität (eines sog. "Transkriptionsfaktors") aufweist, fokussierte die Suche nach den der Chemotherapieresistenz zugrundeliegenden molekularen Mechanismen auf die Identifizierung von durch EVI1 regulierten Genen. Durch genomweite Untersuchungen wurden mehrere Dutzend solcher Gene gefunden. Interessanterweise gab es eine signifikante Überschneidung zwischen der Gruppe der durch EVI1 regulieren Gene und der in einem Parallelansatz identifizierten Gruppe der durch Chemotherapeutika regulierten Gene. Dies könnte bedeuten, dass Überexpression von EVI1 eine Prä-Adaptation der malignen Zellen bewirkt, die es ihnen in der Folge erlaubt, sich effektiver vor der toxischen Wirkung der Chemotherapie zu schützen. In weiterführenden Arbeiten wurden drei der durch EVI1 regulierten Gene einer eingehenden Analyse des Mechanismus ihrer Regulation, sowie ihrer spezifischen Rolle bei der durch EVI1 bewirkten Therapieresistenz unterzogen. Obwohl die Ergebnisse in einem Fall noch weiterer Bestätigung bedürfen, konnte für alle drei Gene gezeigt werden, dass die Änderung ihrer Aktivität in der Tat zu der durch EVI1 vermittelten Chemotherapieresistenz beiträgt.