Zytoprotektive Wirkung von Nitrit

Seit nahezu hundert Jahren sind die toxischen Effekte von Nitrit-Anionen, wenn sie in unphysiologisch hohen Konzentrationen eingesetzt werden, bekannt. Jedoch erst kürzlich wurde erkannt, dass Nitrit in niedriger Konzentration zytoprotektiv bei ischämischen Schädigungen in einer Vielzahl von Geweben wirkt. Der Mechanismus der Zytoprotektion ist kaum erforscht, involviert aber die Reduktion von Nitrit zu Stickstoffmonoxid (NO). Die positiven Effekte von Nitrit werden zwei Eigenschaften des NO zugeordnet: Erstens der Fähigkeit zur Regulation sowohl der lokalen Durchblutung als auch der systemischen Zirkulation (über Vasodilatation), und zweites der Fähigkeit zur Modulation intrazellulärer Enzymaktivität, insbesonders der mitochondrialen Funktion. Die Reduktion von Nitrit kann sowohl im Blut als auch im Gewebe erfolgen. Im Blutstrom wird die Reduktion durch Hämoglobin (Hb) in den Erythrozyten katalysiert. Unsere kürzlich erschienene Publikation (MolMed) und weitere vorläufige Daten zeigen, dass der Anteil an NO, welcher durch Nitritreduktion an Hb in den Erythrozyten entsteht, nur in geringem Ausmaß an der Vasodilatation beteiligt ist. Hingegen scheinen intrazelluläre Mechanismen der Nitritreduktion, welche Myoglobin, Xanthinoxidase, Mitochondrien und eNOS umfassen, für die Bioaktivierung von Nitrit verantwortlich zu sein. Das Ziel des vorliegenden Projekts ist es daher, die Mechanismen der intrazellulären Nitratreduktion zu identifizieren, die zu den zytoprotektiven Effekten von Nitrit beitragen. Das Projekt umfasst Arbeiten an Zellhomogenaten, isolierten Mitochondrien und in der Zellkultur. Die nitritabhängige NO-Produktion wird mittels EPR, NO-Elektrode und Konfokalmikroskopie (in Kombination mit entsprechenden Fluoreszenzfarbstoffen) detektiert. Die Bioaktivität von Nitrit wird mittels Bestimmung der Guanylatzyklaseaktiviät (cGMP) und dei mitochondriale Funktion (respiratorische Aktivität) mittels elektrochemischer Methoden und Konfokalmikroskopie verfolgt. Um den Einfluss von Mitochondrien, Myoglobin, Xanthinoxidase und NOS auf die Nitritreduktion zu untersuchen, werden NO-Messungen unter Einfluss von spezifischen Inhibitoren und Antikörpern durchgeführt. Da weiters bekannt ist, dass Myoglobin weit effizienter Nitrit reduziert als Hämoglobin, werden auch Untersuchungen an Geweben bzw. Zellen, die Myoglobin (Herz/Kardiomyozyten, Aorta/Glatte Muskelzellen) bzw. kein Myoglobin (Leber/Hepatozyten) enthalten, durchgeführt werden. Die Ergebnisse dieses Projekts werden dazu beitragen, das Wissen über die Mechanismen der NO-Produktion aus Nitrit zu erweitern, den Einfluss der Nitritreduktion auf die zytoprotektiven Effekte von Nitrit zu klären, die experimentellen Daten von vorangegangenen Ischämie-Reperfusionsstudien zu interpretieren und eine bessere Basis für eine mögliche therapeutische Nutzung von Nitrit zu schaffen.

Ziel des Projekts war es, einen Beitrag zur Bekämpfung von Herz- und Gefäßerkrankungen zu leisten. Stickstoffmonoxid (NO), ein wirksamer Regulator von Herz- und Gefäßfunktionen wird von dem speziellen Enzym NO-Synthase unter normoxischen Bedingungen synthetisiert. Da dieses Enzym sauerstoffabhängig arbeitet, ist es unter hypoxischen Bedingungen nicht hinreichend effizient. Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass Nitrit, welches früher als Endprodukt der Oxidation von NO galt und in geringer Konzentration im Körper vorkommt, als NO-quelle unter hypoxischen Bedingungen in Frage kommt und dazu beiträgt, die Blutversorgung in hypoxischen Organen zu regulieren. Zusätzlich übt Nitrit einen cytoprotektiven Effekt bei ischämischen Verletzungen aus. Die Mechanismen der NO Freisetzung durch die Reduktion (Bioaktivierung) von Nitrit sind jedoch noch unzureichend erforscht. In diesem Projekt wurde versucht, die Mechanismen der Nitrit-Bioaktivierung im Körper zu verstehen, um dadurch die positive Wirkung von Nitrit besser einsetzen und vorhersagen zu können. Im Rahmen dieses Projektes haben wir den predominanten Signalweg, über welchen Nitrit zu NO reduziert und für die Regulation von Herz- und Gefäßfunktionen bereitgestellt wird, bestimmt und einen NO-abhängigen Mechanismus der Zytoprotektion in der einzelnen Zelle nachgewiesen. Wir konnten zeigen, dass die Herzfrequenz durch Nitrit in einer von Erythrozyten (RBC) abhängigen Weise reguliert wird, was darauf hinweist, dass Hämoglobin für die Nitrit-Bioaktivierung hauptverantwortlich ist. Im Gegensatz dazu beeinflusst Nitrit den Blutdruck, die myocardiale Kontraktilität, periphären Widerstand sowie Arteriensteifigkeit, indem es in den funktionellen Organzellen wie zum Beispiel Kardiomyozyten oder Hepatozyten zu NO reduziert wird. Weitere Versuche in Kardiomyozyten zeigten, dass die Freisetzung von NO und die darauf folgende Synthese von cyclischem Guanosinmonophosphat (cGMP), welches die myokardiale Kontraktilität reguliert, von Mitochondrien abhängig sind. Darüber hinaus reduzierte die Zugabe von RBC zu Kardiomyozyten in der Zellkultur die cGMP-Synthese. Ähnliche Mechanismen der Nitritreduktion wurden in Hepatozyten festgestellt. Des weiteren konnten wir zeigen, dass NO aus Kardiomyozyten ins Medium und weiter in benachbarte Zellen diffundiert. Dies legt nahe, dass NO auch in vivo aus dem Gewebe in die Blutgefäße diffundiert und dort den Tonus reguliert. Ein weiterer Erfolg dieser Studie war der Beitrag zum Verständnis der zytoprotektiven Eigenschaft von Nitrit in Zellen. Es ist bekannt, dass Hypoxie oder Ischämie gefolgt von Reoxigenierung zur Zerstörung des mitochondrialen Komplex I und einer damit einhergehenden Freisetzung von Cytochrom c führt, was eine mitochondriale Fehlfunktion zur Folge hat. Wir konnten zeigen, dass Nitrit die Freisetzung von Cytochrom c verhindert, indem es die oxidative Zerstörung der äusseren Membran durch Übergangsmetalle, welche während der Hypoxie freigesetzt werden und die Membran während der Reoxigenierung schädigen, inhibiert. Im Allgemeinen zeigen unsere Daten, dass der Effekt von Nitrit von Mitochondrien und RBC abhängig ist. Dementsprechend können erworbene oder angeborene Fehlfunktionen der Mitochondrien den positiven Effekt von Nitrit vermindern; ein erhöhter Hämatokritwert unterstützt die positive Wirkung von Nitrit auf die Herzfrequenz, verringert jedoch den kardiovaskulären Effekt. Wir konnten weiters beobachten, dass immortalisierte Zellinien im Vergleich zu normalem Gewebe unempfindlicher gegenüber Hypoxie sind und die positiven Effekte von Nitrit in diesen Zelllinien nicht auftreten. Im Augenblick versuchen wir zu verstehen, warum Zelllinien im Vergleich zu normalem Gewebe resistenter gegenüber Ischämie und Nitrit-Behandlung sind.