Lyn und Btk als neue therapeutische Targets bei aggressiven Mastzellerkrankungen

Aggressive Mastzellerkrankungen sind unheilbare Neoplasien welche in der Regel eine Resistenz gegenüber herkömmlichen antineoplastischen Medikamenten und somit eine schlechte Prognose aufweisen. In den meisten Fällen findet sich eine aktivierende Mutation im KIT Proto-Onkogen. Der häufigste Mutant ist KIT D816V. Dieser Mutant findet sich allerdings auch in Patienten mit indolenter Mastozytose, die zumeist stabil verläuft und mit einer normalen Lebenserwartung einhergeht. Ebenso wurde gezeigt, dass KIT D816V kein komplett transformierendes Onkoprotein ist und dass KIT D816V-blockierende Medikamente keine dauerhaften Remissionen in aggressiven Mastozytosen induzieren können. Diese Beobachtungen lassen den Schluss zu, dass zusätzliche KIT-unabhängige Signalwege und Moleküle in der malignen Transformation der Mastzellerkrankungen eine Rolle spielen. Unsere rezenten Studien haben gezeigt, dass neoplastische Mastzellen konstitutiv aktiviertes Lyn und Btk exprimieren, und dass der Tyrosinkinaseinhibitor PKC412 zwar KIT D816V und diverse nachgeschaltete Signalmoleküle in den neoplastischen Mastzellen blockieren kann, nicht jedoch Lyn und Btk. Überdies zeigen preliminäre Daten aus unserem Labor, dass ein spezifischer knock-down von Btk mittels siRNA das Wachstum und das Überleben der neoplastischen Mastzellen hemmt. Aufgrund dieser Daten wurde nun die Hypothese erstellt, dass der Lyn/Btk Signalweg und nachge-schaltete Effektormoleküle eine Rolle in der Progression der Mastzellerkrankungen spielen könnten. Das Ziel des vorliegenden FWF Projektes ist es, die funktionelle Rolle des Lyn/Btk Signalweges und seiner Komponenten im Wachstum von neoplastischen Mastzellen zu untersuchen, sowie dessen Eignung als neues KIT- unabhängiges therapeutisches Target in der Mastozytose zu prüfen. Das geplante Projekt beinhaltet die Verwendung von humanen und kaninen Mastzelltumor-Modellen, sowie Ba/F3 Zellen und humanen Progenitorzellen mit induzierbarer KIT D816V Expression, welche im Labor des Antragstellers etabliert wurden. Sowohl siRNA als auch Tyrosinkinaseinhibitoren (dasatinib, INNO-406, LFM-A13), welche KIT und/oder Btk und/oder Lyn blockieren, werden eingesetzt, um die funktionelle Rolle dieser Tyrosinkinasen zu untersuchen. Weitere Ziele des Projektes sind es, Lyn/Btk-upstream targets zu identifizieren und Lyn/Btk-blockierende und KIT-blockierende Medikamente zu kombinieren, um eine optimale (synergistische) Hemmung des Wachstums von neoplastischen Zellen zu erreichen. Die entsprechenden Experimente werden mit HMC-1 Zellen mit oder ohne KIT D816V Mutation, sowie mit primären neoplastischen Mastzellen durchgeführt. Um das Spektrum der KIT Mutationen zu erweitern und ein in vivo Modell zu entwickeln, werden zusätzlich kanine neoplastische Mastzellen und C2 Zellen verwendet. Es ist zu erwarten, dass die Daten, welche im Rahmen des Projektes erhoben werden nicht nur entscheidend zu unserem Verständnis der Pathogenese der Mastzellerkrankungen beitragen, sondern auch neue Wege in der pharmakologischen Beeinflussung der proonkogenen Signalwege in den neoplastischen Mastzellen aufzeigen können. Die daraus gewonnenen Erkenntnisse könnten entscheidend dazu beitragen, neue verbesserte Verfahren für die Diagnostik und Therapie der aggressiven Mastzellerkrankungen zu entwicklen.

Die systemische Mastozytose ist eine Erkrankung, welche durch eine unkontrollierte Vermehrung von Gewebsmastzellen gekennzeichnet ist. Die Erkrankung kann einen gutartigen, einen aggressiven oder sogar einen leukämischen Verlauf nehmen. Die entarteten Mastzellen weisen in allen Varianten der Erkrankung eine tumorinduzierende Mutation (D816V) im Wachstumsfaktorrezeptor KIT auf. Unbekannt ist, welche zusätzlichen molekularen Veränderungen zu einer Transformation der Erkrankung führen. Wir haben jüngst zwei KIT D816V-unabhängige wachstums-fördernde Moleküle in entarteten Mastzellen identifiziert, nämlich Lyn und Btk. In der aggressiven Mastozytose und in der Mastzellleukämie exprimieren die Mastzellen zumeist beide Moleküle in aktivierter Form, was in den nicht-aggressiven Varianten der Erkrankung nicht der Fall ist. Im Zuge des aktuellen Projektes konnten wir nachweisen, dass Lyn und Btk aktiv das tumoröse Wachstum und das Überleben der entarteten Mastzellen fördern, und dass Medikamente, welche eines der beiden oder alle beide Moleküle blockieren, das Wachstum der neoplastischen Zellen hemmen. Weiters konnte gezeigt werden, dass eine Kombination aus Medikamenten, welche einerseits KIT und andererseits Lyn und/oder Btk inaktivieren, das Wachstum tumoröser Mastzellen im Vergleich zum Einzelmedikament nachhaltiger hemmt. Im vorliegenden Projekt haben wir auch nach weiteren tumor-induzierenden Molekülen und potentiellen Zielstrukturen in entarteten humanen und kaninen (Hunde) Mastzellen gesucht. Hier fanden sich unter anderem die Oberflächenmoleküle CD30 und CD52, welche als Zielstrukturen fungieren können. Diese Oberflächenmoleküle werden allerdings nicht durch Lyn oder Btk reguliert. Gegenstand weiterer Untersuchungen war die Fragestellung, ob Lyn und/oder Btk selbst in mutierter Form in entarteten Mastzellen vorliegen, was allerdings nicht nachweisbar war. In einem weiteren Schritt haben wir die Fragestellung bearbeitet, ob tumoröse Mastzellen andere aktivierende Mutationen im Genom exprimieren, die eine sekundäre Aktivierung von Lyn und Btk erklären könnten. Auch hier konnten keine aktivierenden Mutationen in den untersuchten Genen gefunden werden. Ebenso wurde untersucht, ob tumoröse Mastzellen virale Gene (EBV, CMV, HPV, HCV) exprimieren, die eine Aktivierung von Lyn und/oder Btk erklären könnten, aber auch diese Versuche erbrachten keine positiven Resultate. Abschließend haben wir überprüft, ob Wachstumsfaktoren wie IL-3, IL-4, IL-9, IL-10 oder IL-13 die Aktivierung von Lyn und Btk in den entarteten Mastzellen induzieren könnten, aber auch hier war kein aktivierender Effekt nachweisbar. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass eine pharmakologische Beeinflussung des aktivierten Lyn/Btk Signalweges eine potentielle neue zielgerichtete Behandlungsmöglichkeit der aggressiven Mastozytose und Mastzellleukämie darstellen könnte. Noch wesentlicher erscheint die Erkenntnis, dass eine sorgfältig ausgewählte Kombination von zielgerichteten Medikamenten entartete Mastzellen besonders wirkungsvoll eliminieren kann. Diese Beobachtung könnte klinische Implikationen haben und könnte als wichtige Grundlage zur Vorbereitung von klinischen Studien dienen, da sowohl die aggressive Mastozytose als auch die Mastzellleukämie noch immer unheilbare Erkrankungen darstellen, und mit einer kurzen Überlebenszeit bei Hunden und Menschen einhergehen.