Einbringung eines NeuNAc Synthesewegs in Trichoderma

N-Acetylneuraminsäure (NeuNAc) ist ein C9-Monosaccharid und der wichtigste Vertreter der Sialinsäuren. Derzeit sind über 50 natürlich vorkommende Derivate der Sialinsäuren bekannt. Von NeuNAc wird angenommen, dass es für alle Derivate als Precursor dient, da alle bekannten biochemischen Stoffwechselwege über NeuNAc führen. Sialinsäuren werden im biologischen System zumeist als endständige Komponente von Glykoproteinen an der Zelloberfläche präsentiert. An dieser Stelle dienen sie als Erkennungsstellen für diverse endo- wie auch exogene Proteine, die der Klasse der Lektine angehören. Aufgrund dieser ausgezeichneten Position im Zellsystem kommt den Sialinsäuren auch eine entscheidende Rolle im Infektionszyklus einiger bedeutender Viruserkrankungen wie des Influenzaviruses A und B zu. In diesem Fall binden neugebildete Viruspartikel an die Sialinsäure an der Zelloberfläche. Für eine weitere Ausbreitung des Virus im Körper bedarf es daher der Wirkung einer Neuraminidase (Sialidase), welche in der Lage ist die Verbindung zwischen Sialinsäure und Glykoprotein zu spalten. Sialinsäurederivate werden daher in der Therapie solch gearteter Viruserkrankungen als Inhibitoren der Neuraminidasen (Neuraminidasehemmer) eingesetzt um eine weitere Verbreitung des Virus zu unterbinden. Bekanntestes Präparat auf dem Markt ist "Tamiflu" (Wirkstoff Osemtalvir) von Hoffmann la Roche. Ein weiteres Präparat "Relenza" (Wirkstoff: Zanamivir) von GlaxoSmithKline ist auch ein Neuraminidasehemmer, der aus dem Ausgangsstoff NeuNAc hergestellt wird. Relenza gilt derzeit als besonderer Hoffnungsträger bei der Anwendung gegen Vogelgrippe. Die Synthese von NeuNAc ist aufwendig und wird heute mithilfe eines zweistufigen, enzymkatalysierten Prozesses bewältigt. Besonders nachteilig auf die Produktionskosten wirkt sich hierbei der letzte Syntheseschritt aus. Dabei wir N-Acetylmannosamin zu NeuNAc in einer Gleichgewichtsreaktion umgesetzt, wobei Pyruvat im Überschuss zugeführt werden muss um das Gleichgewicht in Richtung NeuNAc zu verändern. Pyruvat ist jedoch anschließenden nur sehr kostenintensiv abzutrennen. Um die Synthese von NeuNAc in Zukunft kostengünstiger zu gestalten, soll ein Ganzzellprozess geschaffen werden. Dafür soll ein filamentöser Ascomycet der Gattung Trichoderma genetisch so manipuliert, dass der resultierende Stamm in der Lage ist NeuNAc zu synthetisieren. Dieses System hätte einige wesentliche Vorteile gegenüber dem derzeitigen biokatalytischen Prozess: die Biosynthese von NANA in vivo kann im Gegensatz zur derzeit verwendeten Aldolase durch eine Synthase ausgeführt werden. Diese verwendet statt Pyruvat Phosphoenolpyruvat (wird im angestrebten Prozess von der Pilzzelle zur Verfügung gestellt); die Umsetzung wird dadurch zu einem irreversiblen Prozess. Daher wird der Einsatz eines Pyruvat Überschusses obsolet und der Downstream-Prozess in Folge erheblich vereinfacht. Weiters bietet der Einsatz des Pilzes Trichoderma einen Vorteil bezüglich der einzusetzenden Rohstoffe. Pilze der Gattung Trichoderma sind bekannt für ihre hohe sekretorische Kapazität an extrazellulären Enzymen. Deswegen sind diese Organismen auch in der Lage diverse in der Natur vorkommende Biopolymere wie zum Beispiel Cellulose, Xylan und auch Chitin effizient abzubauen. Bei einem möglichen Prozess kann diese Eigenschaft dahingehend Verwendung finden, dass als kostengünstiger Rohstoff zum Beispiel Abfälle aus der Meeresfrüchteverarbeitung (e.g. Krabbenpanzer) eingesetzt werden. Diese enthalten als Gerüstsubstanz große Mengen von Chitin, welches aus N-Acetylglucosamin Einheiten (NAGA) aufgebaut ist. NAGA ist der Precursor für die biochemische Synthese von NeuNAc; das geplante Projekt folgt damit der Idee nachwachsende Rohstoffe auf biokatalytischem Wege in Feinchemikalien umzusetzen.

Im Zuge der vom FWF geförderten Forschungsstudie ist es gelungen, eine pharmakologisch wichtige Grundsubstanz für Virusstatika in einem biotechnologischen Prozess aus dem nachwachsenden Naturstoff Chitin herzustellen. In der Therapie von viralen Infekten (zB Influenza) werden häufig sogenannte Neuraminidasehemmer eingesetzt. Diese verhindern, dass eine am Ende einer Glykoproteinantenne befindliche Neuraminsäure vom Glykoprotein abgespalten wird und somit auch die Verbreitung des Virus im befallenen Organismus. Derivate der N-Acetylneuraminsäure werden häufig als Neuraminidasehemmer verwendet, so zum Beispiel Zanamivir, der aktive Wirkstoff im Medikament, das unter dem Marktnamen Relenza von GlaxoSmithKline vertrieben wird. N-Acetylneuraminsäure wird derzeit vor allem durch Extraktion aus natürlichen Ressourcen gewonnen oder durch chemische Synthese hergestellt und hat daher einen relativ hohen Marktpreis (ca. 1000 pro Gramm). Chitin ist das zweithäufigste Biopolymer auf der Erde und ist vor allem in den Panzern von Krebstieren und Insekten, in Reibzungen von Weichtieren, in den Schnäbeln von Cephalopoden und in Zellwänden von Pilzen zu finden. Man schätzt, dass jährlich 1011 Tonnen Chitin alleine im maritimen Bereich gebildet werden. Im Sinne der Nachhaltigkeit ist Chitin als erneuerbarer Rohstoff somit ein optimaler Ausgangsstoff für Syntheseprozesse. Der in Böden, Wald und Wiesen verbreitete Pilz Trichoderma ist in der Lage, Chitin zu seinem monomeren Aminozucker (N-Acetylglukosamin) abzubauen. Deswegen wurde dieser Organismus ausgewählt und ein künstlicher Syntheseweg für die Herstellung von N-Acetylneuraminsäure eingebracht. Der neu entwickelte Stamm produziert nun in einem Ganzzellkatalyseansatz, d.h. im Zuge einer Kultivierung in einem Bioreaktor, von Chitin die gewünschte Substanz. Die TU Wien hat die vielversprechende Erfindung aufgegriffen und patentiert.